細(xì)胞工程-動物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)與原理-資料下載頁
2025-01-25 16:46本頁面
【正文】 培養(yǎng)后，標(biāo) 記出保留細(xì)胞，在顯微鏡下切下保留細(xì)胞處瓊脂小塊，在 BSS中輕 輕漂洗后，用適應(yīng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。 （ 3）多孔塑料板分離法（ foamed plastics Separation） 將 1ml含有 7~8個細(xì)胞的懸液接種到多孔無毒塑料板中，每一塊板上有數(shù)十個圓形小穴。選擇僅有單個細(xì)胞的小孔觀察，待單細(xì)胞繁殖成克隆充滿小孔后，用胰酶消化分離細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。 六、細(xì)胞的常規(guī)檢查（ corpuscular routine examination） 檢查內(nèi)容：細(xì)胞的生長狀態(tài)、培養(yǎng)液 pH 、污染、細(xì)胞活力。 細(xì)胞生長 潛伏期：不同組織和細(xì)胞潛伏期不同。 胚胎組織 ——次日可見生長， 1周內(nèi)即連接成片。 老年組織、癌組織 ——潛伏期長。 ⑴ 游離期 細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)。細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓形。 ⑵ 吸附期 ：與細(xì)胞種類、培養(yǎng)環(huán)境有關(guān)。 大多數(shù)在 24h內(nèi)貼壁。細(xì)胞機能狀態(tài)不良或瀕死細(xì)胞不貼壁 培養(yǎng)基偏酸或偏堿、污染、膠基有毒、培養(yǎng)瓶洗刷不潔等均不利于細(xì)胞貼壁。 支持物表面帶正電荷利于貼壁。 ⑶ 繁殖期 （ idiophase） 細(xì)胞由圓形變成延展細(xì)胞，進(jìn)而過渡成極性細(xì)胞；繼之出現(xiàn)細(xì)胞 分裂，細(xì)胞數(shù)目不斷增多；同時有一定的移動現(xiàn)象。 ⑷ 退化期 （ catagen） 細(xì)胞長滿瓶壁后，如不及時做再培養(yǎng)，由于營養(yǎng)物消耗和代謝物 積累，細(xì)胞變得粗糙（輪廓分明、胞內(nèi)顆粒狀物堆積），嚴(yán)重時 甚至從瓶壁脫落。 細(xì)胞形態(tài)（ cellular shape） 生長良好細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察透明度大，輪廓不清。 機能不良細(xì)胞：輪廓鮮明，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀 物；細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，失去原有特點；細(xì)胞間隙加大。 培養(yǎng)液 pH 正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色。 隨細(xì)胞生長時間延長， CO2積累增多，超出緩沖范圍后酸化變黃， 須及時更換。 微生物污染 (microbial contamination) 常見來源：培養(yǎng)液、培養(yǎng)塞、血清、操作時空氣污染。 常見病菌： 霉菌、細(xì)菌、支原體。 ⑴霉菌：培養(yǎng)基中出現(xiàn)相應(yīng)的菌落。 ⑵細(xì)菌：培養(yǎng)液混濁，鏡下可見大量細(xì)菌；如懷疑污染而培養(yǎng)液無 明顯改變時，可將培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)以驗證。 ⑶支原體污染： 經(jīng)常發(fā)生而難以發(fā)現(xiàn)。 污染后的細(xì)胞仍能生存，甚 至無明顯變化；有時可發(fā)生不同程度的病理改變。 預(yù)防方法：嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。并針對不同污染采取相應(yīng)措施。 細(xì)胞活性 (cytoactive) 原理：細(xì)胞對色素的吸附性 方法：常用的是染色排除法，即 死細(xì)胞著色法 ⑴臺盼藍(lán)染色： ，溶于 100ml Hanks液， 調(diào) pH至 ~。按細(xì)胞懸液：染液 =9： 1比例混合， 4min后計數(shù)。注意時間過長，活細(xì)胞亦可受損而著色。 ⑵ 苯胺黑染色： %苯胺黑（溶于 Hanks液）同上比例染色，稍放置后鏡檢。注意苯胺黑溶解性較差，用前應(yīng)先過濾。 ⑶藻紅 B染色： %藻紅 B（溶于 Hanks液）染色， 2h內(nèi)鏡檢。注意藻紅 B易同蛋白質(zhì)結(jié)合，須把血清洗凈。 另：活細(xì)胞著色法 結(jié)晶紫染色： %結(jié)晶紫（溶于 Hanks液）染色，混合后立即鏡檢。 七、動物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)（ zooblast mass culture） 培養(yǎng)方式 反應(yīng)物 營養(yǎng)液 評價 分批式培養(yǎng) 一次性取出 一次性加入 后期細(xì)胞生長不良 根據(jù)細(xì)胞生長 流加式培養(yǎng) 一次性取出 情況及時補充 細(xì)胞生長環(huán)境平穩(wěn) 反饋控制流加 無反饋控制流加 經(jīng)一段時間分 取出反應(yīng)物同時 適用于微載體 半連續(xù)培養(yǎng) 批式培養(yǎng)，取 補充等量新的營 培養(yǎng)系統(tǒng) 出部分反應(yīng)物 養(yǎng)液 保持細(xì)胞優(yōu)化狀態(tài)， 有利于細(xì)胞、產(chǎn)物 連續(xù)培養(yǎng) 不斷地取出 不斷地加入 的連續(xù)生產(chǎn)和細(xì)胞 （灌注培養(yǎng)） 生理、代謝規(guī)律的研究 八、細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇技術(shù) (cell freeze resuscitation technique) 細(xì)胞的凍存 * 細(xì)胞系和細(xì)胞株的保存：超低溫冰箱、液氮罐冷凍保護(hù)劑的作用：結(jié)合細(xì)胞中水分子，降溫時減少細(xì)胞內(nèi)冰晶分子的形成，以免對細(xì)胞造成傷害。 常用冷凍保護(hù)劑： DMSO、甘油。 * 細(xì)胞的復(fù)蘇：慢凍快融， 迅速投入 37℃ 水浴中 演講完畢，謝謝觀看！
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