細(xì)胞工程-動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)與原理(已改無(wú)錯(cuò)字)
2023-02-13 16:46:40 本頁(yè)面
【正文】 作用 2~5min； ② 檢查 ：如細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞質(zhì)回縮，則終止消化。 ③ 終止 消化：吸出消化液；加入 Hanks液，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，洗去殘留 的消化液。如單用胰蛋白酶，可直接加入培養(yǎng)液。 ③細(xì)胞 計(jì)數(shù) ：用吸管輕輕吹打瓶壁，使細(xì)胞脫落，制成懸液， 計(jì)數(shù)并記錄其濃度； ④重新稀釋 接種 培養(yǎng)。 根據(jù)細(xì)胞特點(diǎn)，掌握細(xì)胞消化時(shí)間和選擇消化方法。 （三）組織塊單層細(xì)胞培養(yǎng)法 (tissue monolayer method ) 把組織剪成更小的小塊（ ~1mm3），由于其體積很小，無(wú)需任何粘著劑即能直接附于瓶壁上。細(xì)胞自組織塊邊緣向外長(zhǎng)出，最后連接成片，形成單層細(xì)胞。 優(yōu)點(diǎn)： 簡(jiǎn)化了原代單層細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程。是當(dāng)前各培養(yǎng)室常用的原代培養(yǎng)法。 方法： ①取一定量組織置于小燒杯中，先用 BSS漂洗 2~3次去掉血污，然后反復(fù)剪成 ~1mm3的小塊。 ②加入 1~2ml培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打，使組織塊懸浮。 ③移入培養(yǎng)瓶，并在瓶壁上吹勻。翻轉(zhuǎn)，使有組織塊的瓶壁朝上， 加入培養(yǎng)液，塞緊瓶口，置 37℃ 溫箱培養(yǎng) 1~2h；待組織牢固貼于瓶 壁，再輕輕翻轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)液浸泡組織小塊，靜止培養(yǎng)。為促進(jìn)細(xì)胞 貼壁，也可先在瓶?jī)?nèi)壁涂一層血清。 （四）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法 (suspended cell culture) 利用旋轉(zhuǎn)、振搖或攪拌的方法不讓細(xì)胞貼壁，使其在培養(yǎng)液中 呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。 適用細(xì)胞 ：淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、傳代細(xì)胞系 培養(yǎng)基 ：合成培養(yǎng)基 ＋ 5~10%血清 ＋ %甲基纖維素 培養(yǎng)細(xì)胞密度 ： 5~7 105cell/ml. 特點(diǎn)：細(xì)胞增殖快，產(chǎn)量高，培養(yǎng)過(guò)程簡(jiǎn)單，是動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培 養(yǎng)的理想模式。 （五）微載體培養(yǎng)法 (microcarrier culture) 載體 ： DEAE交聯(lián)葡聚糖微粒、 DEAE纖維素、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、無(wú)機(jī)玻璃基質(zhì)微載體等 微載體培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞步驟： 選擇合適的微載體類型 ——獲得最大量的細(xì)胞，以微載體能全部懸浮在培養(yǎng)液內(nèi)為最好 浸泡水化及消毒 用無(wú) Ca2+、 Mg2+離子的磷酸緩沖液浸泡 3h以上 接種（根據(jù)細(xì)胞類型決定接種濃度） 培養(yǎng)觀察與細(xì)胞計(jì)數(shù) 消化 分離細(xì)胞或傳代培養(yǎng) （六）多孔載體培養(yǎng) (porosity carrier culture) 優(yōu)點(diǎn)：增加細(xì)胞固定化穩(wěn)定性，比表面積大，保證細(xì)胞充分的生 長(zhǎng)空間，細(xì)胞生長(zhǎng)在載體內(nèi)部，免受機(jī)械損傷。 多孔載體被證明是用于大規(guī)模高密度細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)秀細(xì)胞生長(zhǎng) 支持物，具有逐步取代傳統(tǒng)的實(shí)心微載體的趨勢(shì)。 （七）中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)法 (hollow fiber cell culture) 模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的三維狀態(tài)，利用人工的“毛細(xì)血管” —— 中空纖維來(lái)供給細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)等條件 細(xì)胞向三維空間生長(zhǎng)繁殖，形成類似組織的多層細(xì)胞群體，細(xì)胞 密度可達(dá) 109個(gè) /ml 。 適用于細(xì)胞代謝產(chǎn)物和分泌物的生產(chǎn)。 五、細(xì)胞系與克隆株（ cell line and clone） 細(xì)胞系的建立 原代培養(yǎng)的培養(yǎng)物中所含的細(xì)胞類型多而復(fù)雜，培養(yǎng)初期，生長(zhǎng)的 細(xì)胞類型多種多樣隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)：一些細(xì)胞退化、死亡；另一些 細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境而生長(zhǎng)繁殖培養(yǎng)物逐步變均勻。 傳代培養(yǎng)意義：不僅在于維持細(xì)胞不斷地生長(zhǎng)，而且使培養(yǎng)物逐 步演變?yōu)榫哂性鲋衬芰?、特征專一、類型均勻的培養(yǎng)細(xì)胞，即 細(xì)胞 系。 細(xì)胞系： *指從原代培養(yǎng)物經(jīng)傳代培養(yǎng)后得來(lái)的一群特征專一、類 型均勻的細(xì)胞，可以長(zhǎng)期連續(xù)傳代。 （ 1）限定細(xì)胞系（有限細(xì)胞系） 壽命有限，一般為 20~80代 （ 2）連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞系（無(wú)限細(xì)胞系） 細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，可連續(xù)培養(yǎng)和生長(zhǎng)，壽命變?yōu)椤盁o(wú)限” 克隆株（細(xì)胞株） 分離單一細(xì)胞并使其繁殖形成的細(xì)胞群稱為 細(xì)胞株。 單個(gè)細(xì)胞的生活能力很弱，必須采取特殊的培養(yǎng)措施 適應(yīng)和同化過(guò)程 ：在細(xì)胞接種到新培養(yǎng)液的初期，細(xì)胞既從培養(yǎng)液 中攝取營(yíng)養(yǎng)，也要向培養(yǎng)液排出一定物質(zhì)，其結(jié)果使得培養(yǎng)液更易 被吸收和利用。 適應(yīng)培養(yǎng)液 制備：選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，無(wú)死細(xì)胞和碎片，所用細(xì)胞的種類應(yīng)與要克隆的細(xì)胞相同。吸出培養(yǎng)液，用 G6濾器過(guò)濾貯于冰箱中備用。 制備適應(yīng)性培養(yǎng)基時(shí)注意：選用成分齊全的合成培養(yǎng)基，可不加抗生素。 細(xì)胞株的制備方法（ 3種）： （ 1）集落形成分離法 平皿中接種稀釋細(xì)胞 細(xì)胞貼壁 繁殖成許多小群 選擇一個(gè)最好的細(xì)胞群做標(biāo)記 機(jī)械法刮除所有其他細(xì)胞群 培養(yǎng)保留下來(lái)的細(xì)胞群 . 克隆成功的關(guān)鍵： ①接種細(xì)胞數(shù)量要合適、細(xì)胞要分散得好。 太多則使細(xì)胞操作不便，以每個(gè)平皿 50~100個(gè)細(xì)胞為宜。 ②選擇細(xì)胞克隆時(shí)，應(yīng)逐日觀察，能證明被選留的細(xì)胞群確系來(lái)自于單個(gè)細(xì)胞。刮除和洗滌一定要徹底。 （ 2）瓊脂分離法 （ agar Separation） 瓊脂培養(yǎng)基的制備： 選擇質(zhì)量好的瓊脂，用三蒸水配成 3%的溶液，分裝，滅菌。 培養(yǎng)方法： 向瓊脂平皿中接種稀釋細(xì)胞懸液（適應(yīng)培養(yǎng)基），
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