【正文】 后，不再增加。 密度依賴性 （ Density inhibition） ? 3T3細(xì)胞系，在細(xì)胞稀少狀態(tài)下培養(yǎng)時，其生長迅速；但一旦細(xì)胞生長匯合成一片時（每 6cm培養(yǎng)皿約 106個細(xì)胞），其分裂增殖停止。上述這種生長特性即為密度依賴性調(diào)節(jié)（或密度抑制）。 （四） 體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長與增殖過程 單個細(xì)胞的生長過程： 與體內(nèi)細(xì)胞周期相似，經(jīng)歷 G S、 G M期。 ? ?? 特點(diǎn)：原代細(xì)胞培養(yǎng)通常為異質(zhì)性，細(xì)胞獨(dú)立生存性差，多呈二倍體核型，更能代表其來源組織的細(xì)胞類型及組織特異性，是檢測藥物的很好實驗工具。 ? 特點(diǎn) :在細(xì)胞整個生命期中此期的持續(xù)時間最長， 一般情況下，可傳代 10～ 50代。 ? 有限細(xì)胞系和永久細(xì)胞系 ? 動物細(xì)胞離體培養(yǎng)起始物，我們稱之為原代培養(yǎng)（ primary culture）。 ? 有限細(xì)胞系： 細(xì)胞自動物體內(nèi)取出后，在培養(yǎng)中僅持續(xù)生長有限時間，然后將自行停止生長。這種壽命僅能維持一段時間的細(xì)胞系，稱為有限細(xì)胞系。 ? 有限細(xì)胞系轉(zhuǎn)換成永久細(xì)胞系的過度期稱為轉(zhuǎn)換期 (crisis)，其轉(zhuǎn)換過程在動物細(xì)胞培養(yǎng)中稱為體外轉(zhuǎn)化 (in vitro transformation)。 熒光原位雜交顯示端粒 結(jié)果：細(xì)胞群體中具有迅速增殖能力的細(xì)胞將漸占優(yōu)勢而非增殖的或增殖緩慢的細(xì)胞將被減弱。 ??? 細(xì)胞在第二期末或第三期初階段，通過所謂“危機(jī)期” (crisis)，獲得不死性而具有持久或無限增殖的能力。 每代細(xì)胞的生長過程 在細(xì)胞的生長過程中，繁殖到一定密度后，將之分開而移至新的培養(yǎng)皿中稱為接種。 潛伏期 每代細(xì)胞的生長階段 ： 指數(shù)生長期 停止期 ? 培養(yǎng)細(xì)胞傳代的生存期： 1)潛伏期 (latent phase) 2)指數(shù)生長期 (logarithmic growth phase)又稱對數(shù)期 試驗用 3)平臺期又稱生長停滯期 (stagnate phase)。持續(xù) 3~5天。在此階段，若細(xì)胞處于理想的培養(yǎng)條件，將不斷生長繁殖，細(xì)胞數(shù)量日漸增加。因接觸抑制而細(xì)胞運(yùn)動停止、密度抑制而細(xì)胞終止分裂。 3 平臺期 ? 又稱生長停滯期。 ? 特點(diǎn)細(xì)胞雖已停止生長，但仍存在代謝活動并可繼續(xù)存活一定的時間。否則細(xì)胞因中毒而發(fā)生死亡。 （分解彈性纖維） 動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本過程 過程 組織 取材 組織細(xì)胞的 分離 培養(yǎng) 機(jī)械法 消化法 機(jī)械法分離胚胎 （二）、 原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)技術(shù) 原代培養(yǎng)分為兩種： 1） 組織塊培養(yǎng)法 2） 組織消化培養(yǎng)（單層培養(yǎng)法）：適用于細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎、羊膜、上皮、肝腎及傳代細(xì)胞等。 （一）取材 ⑥ ① ② ③ ④ ⑤ 基本步驟：無菌取出目的組織 ↓ 用利刀無菌切割成 1～ 2mm小塊 ↓ 以 Hanks液漂洗干凈 ,低速離心，棄上清 移入培養(yǎng)瓶，加入適當(dāng)培養(yǎng)基浸潤 ↓ 培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn) 1800，置 15～ 30分，使其貼壁 ↓ 培養(yǎng)瓶翻回，置于 37℃ 培養(yǎng) （ 1）組織塊培養(yǎng) 組織塊培養(yǎng)法 a：取材修剪沖洗 b：剪切成 1mm3左右的小塊 c：移入培養(yǎng)瓶 d：分布組織小塊間距 5mm e：翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶并加培養(yǎng)液 37℃ 靜止 12h f：翻正培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng) g：原代細(xì)胞生長 取材分離和組織消化 無菌取出目的組織 ↓ 用利刀無菌切割成細(xì)塊 ↓ 胰蛋白酶液消化 ↓ Hanks液漂洗兩次，低速離心棄上清 ↓ 吸管吹打分散細(xì)胞 ↓ 移入培養(yǎng)瓶薄層培養(yǎng) (2)組織消化培養(yǎng) 加入 3050倍體積 %濃度胰蛋白酶溶液 37℃ 消化 3060min，每 510min搖動一次 相關(guān)酶類包括：胰蛋白酶、膠原酶、鏈霉蛋白酶、黏蛋白酶、蝸牛酶等，需根據(jù)酶及組織成分的特點(diǎn)選擇使用 原代培養(yǎng)與檢查 ? 接種、培養(yǎng) ? ↓ ? 常規(guī)檢查 （檢查細(xì)胞形態(tài)及活力、檢查營養(yǎng)液 pH及污染） 傳代培養(yǎng)技術(shù) ? 傳代：當(dāng)原代培養(yǎng)成功后，細(xì)胞分裂增殖成片時，需要對其分離重新培養(yǎng)，這一操作過程成為傳代。過早產(chǎn)量不足，過晚細(xì)胞狀態(tài)不佳。 直接傳代法：懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除 l／ 2一 2／ 3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。 凍存意義： 1）長期保存細(xì)胞； 2）防止細(xì)胞老化； 3）減少人力、經(jīng)費(fèi)，減少污染。 ? 在細(xì)胞凍存時要盡可能均勻地減少細(xì)胞內(nèi)水分， 減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成是減少細(xì)胞損傷的關(guān)鍵。 ? 復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。 ? 常用的低溫保護(hù)劑是 甘油或 DMSO，滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。 慢凍程序 ? 標(biāo)準(zhǔn)程序： ? 當(dāng)溫度在 25 ℃ 以上時， 1～ 2 ℃ /min ? 當(dāng)溫度達(dá) 25 ℃ 以下時， 5～ 10 ℃ /min ? 當(dāng)溫度達(dá) 100℃ 時，可迅速放入液氮中 ? 簡易程序： ? 將冷凍管 （ 管口要朝上 ） 放入紗布袋內(nèi) ， 紗布袋系以 線繩 ，通過線繩將 紗布袋固定于液氮罐罐口 ， 按每分鐘溫度下降 1～ 2 ℃ 的速度 ， 在 40分鐘內(nèi)降至液氮表面 ， 停 30分鐘后 ， 直接投人液氮中 。 凍存 1)傳統(tǒng)方法：冷存管置于 4℃ 10分鐘 → 20℃ 30分鐘 → 80℃ 16～ 18小時 (或隔夜 )→ 液氮槽長期儲存。 (2)程序降溫：利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以 1～ 3℃ /分鐘之速度由室溫降至 (80℃ 以下 )120℃ ，再放在液氮長期儲存。 ?凍存要點(diǎn)： 1）慢凍 2）取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行凍存，無微生物污染； 3）細(xì)胞濃度：達(dá)到 10 6/毫升 4）合適的冷凍保護(hù)劑： DMSO,常用 10%。 ? 程序： （ l） 從液氮中取出冷凍管 ， 迅速投入 37～ 38 ℃ 水浴中 ， 使其融化 （ 1分鐘左右 ） 。 （ 3） 低速離心 10分鐘 。 二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法 ? 懸滴培養(yǎng)法 ? 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 ? 灌注小室培養(yǎng)法 ? 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)方法 ? 培養(yǎng)板培養(yǎng)法 ? 克隆培養(yǎng)法 懸滴培養(yǎng)法 ? 懸滴培養(yǎng)法：又稱植塊懸滴培養(yǎng)法， 1907年，哈里森首創(chuàng)。 ? 優(yōu)點(diǎn)： 1）容易換片。 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 ? 蓋爾（ Gey， 1933年）、劉易斯（ Lewis， 1934年）建立該方法。包括旋轉(zhuǎn)管、旋轉(zhuǎn)鼓、支架等。 灌注小室培養(yǎng)法 ? 在蓋玻片懸滴法基礎(chǔ)上發(fā)展而來，可用于連續(xù)觀察細(xì)胞動態(tài)變化，研究各種因素影響作用及活細(xì)胞反應(yīng)。 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)方法 ? 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)方法：指將培養(yǎng)對象直接接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。 Earle設(shè)計了 T培養(yǎng)瓶。 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)瓶 滾動培養(yǎng)瓶 ? 蓋玻片 +培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法：先以蓋玻片為生長表面，將擬培養(yǎng)細(xì)胞或組織接種于蓋玻片上，然后放進(jìn)培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。 培養(yǎng)板培養(yǎng)法 ? 培養(yǎng)板培養(yǎng)法又稱微量培養(yǎng)法。 三 動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是建立在貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)法基礎(chǔ)上，再融合固定化細(xì)胞、流式細(xì)胞術(shù)、填充床、生物反應(yīng)器、人工灌流技術(shù)等發(fā)展起來的。 懸浮培養(yǎng)技術(shù) 適于少數(shù)懸浮生長型細(xì)胞 微載體培養(yǎng)技術(shù) ? 1967年， Van Wezel開發(fā)了微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，以直徑 60250um微珠作為微載體。 ? 理想的細(xì)胞支持物特征 ：生物相容性；無毒害；好的傳質(zhì)特征；機(jī)械穩(wěn)定性好；比表面大，適于細(xì)胞生長；顆粒均一；能高壓滅菌；可重復(fù)利用，易清洗；接種方便；能固定大部分細(xì)胞，能保護(hù)細(xì)胞，易使細(xì)胞、載體和培養(yǎng)基分離；適合貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。 ?多孔載體培養(yǎng) 優(yōu)點(diǎn)：易固定化、比表面大、細(xì)胞在載體內(nèi)生長，免受機(jī)械損傷；可以提高通氣量，強(qiáng)化傳質(zhì)。 多孔載體材料要求：生物相容性、機(jī)械穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性 微囊化培養(yǎng)技術(shù) ? 人造的半透膜制成的多孔微球體，借鑒固定化技術(shù)將細(xì)胞包裹在微囊內(nèi)。 ? 微囊直徑控制在 200400μm為宜。 中空纖維法 ? Richard Kncazek 1972年發(fā)明。 ? 可以模擬細(xì)胞體內(nèi)三維狀態(tài)。 ? 優(yōu)點(diǎn)是： 占地空間少； 細(xì)胞產(chǎn)量高，細(xì)胞密度可達(dá) 109數(shù)量級； 生產(chǎn)成本低，且細(xì)胞培養(yǎng)維持時間長，適用于長期分泌的細(xì)胞 動物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物 （二）動物細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)（ ※ ） 生物反應(yīng)器的特點(diǎn)分析 反應(yīng)器主要結(jié)構(gòu)形式： 攪拌式 氣升式 固定床式 技術(shù)要求：能提供均勻溫和的混合狀態(tài)，剪切力小，傳質(zhì)效果好；反應(yīng)器空間利用率高，選用合適載體系統(tǒng)和材料；能保證嚴(yán)格無菌；能控溫、酸堿、溶氧和 CO2濃度等；能方便快捷實現(xiàn)培養(yǎng)液連續(xù)添加，樣品采集和觀察。 缺點(diǎn)：費(fèi)用高，每一次收液后，都要進(jìn)行一系列新的接種放大 的準(zhǔn)備工作，此期間生產(chǎn)停工。 優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達(dá)到恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定的狀態(tài)下 生長。細(xì)胞容易發(fā)生變異，且對 設(shè)備等要求高。產(chǎn)量高等 . （四）、動物細(xì)胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng) 產(chǎn)品 應(yīng)用 ? 病毒疫苗：乙肝、脊椎灰質(zhì)炎和狂犬疫苗等 ? 非抗體免疫調(diào)節(jié)劑：干擾素、白細(xì)胞介質(zhì)、 B細(xì)胞生長因子、巨噬細(xì)胞激活因子、 T細(xì)胞替代因子等 ? 多態(tài)生長因子：神經(jīng)、成纖維、表皮、血清生長因子等 ? 酶類：組織血纖維酶原激活劑 ? 激素：紅細(xì)胞、促黃體生成素、促濾胞素 ? 腫瘤特異性抗原：癌胚抗原 ? 單克隆抗體 ? 病毒殺蟲劑：桿狀病毒 關(guān)鍵技術(shù) ? 細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境 ：氨離子、乳酸、二氧化碳、甲基乙二醛、滲透壓、載體 … ? 細(xì)胞死亡與凋亡 ：基因工程的調(diào)控 … ? 培養(yǎng)基與細(xì)胞系：無血清培養(yǎng)基的研發(fā)，基因工程的應(yīng)用 … ? 過程監(jiān)控：在線氧吸收速率、葡萄糖分析，親和層析與在線取樣系統(tǒng)偶聯(lián)等 第三節(jié) 培