【正文】 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。 ? 保護劑的濃度在 5~15%之間，常用 10%。 20℃ 不可超過 1小時，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入 80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 5）使用高濃度血清 細(xì)胞復(fù)蘇方法 ? 與快速融化的手段 ， 以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)融化 ， 避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損害 。 （ 4） 去上清 ， 加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞 。 2）培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中，不需移動位置，有利于組織分化。 ? 缺點：不易在顯微鏡下觀察。 ? 1923年，卡雷爾（ Carrel）設(shè)計了卡氏瓶。 ? 優(yōu)點： 1）可以避免培養(yǎng)瓶表面粗糙等原因?qū)ε囵B(yǎng)物的影響 2）可以方便顯微觀察、染色等操作，以及永久保存； 3）增加了培養(yǎng)瓶培養(yǎng)面積。 （一）培養(yǎng)方法 ? 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng) ? 反應(yīng)器貼壁培養(yǎng) ? 懸浮培養(yǎng)技術(shù) ? 微載體培養(yǎng)技術(shù) ? 多孔載體培養(yǎng) ? 微囊化培養(yǎng)技術(shù) ? 中空纖維法 固定化培養(yǎng) 反應(yīng)器貼壁培養(yǎng) ? 此種培養(yǎng)方式中，細(xì)胞貼附于固定的表面生長，不因為攪拌而跟隨培養(yǎng)液一起流動，因此比較容易更換培養(yǎng)液，不需要特殊的分離細(xì)胞和培養(yǎng)液的設(shè)備，可以采用灌流培養(yǎng)獲得高細(xì)胞密度，能有效地獲得一種產(chǎn)品；但擴大規(guī)模較難，不能直接監(jiān)控細(xì)胞的生長情況，故多用于 制備用量較小、價值高的生物藥品。 微載體系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞具體步驟 p110 選擇合適的微載體類型 浸泡水化及消毒 接種 培養(yǎng)觀察和細(xì)胞計數(shù) 消化 分離細(xì)胞 傳代培養(yǎng) 交聯(lián)葡萄糖 DEAE纖維素 蛋白質(zhì)：變性膠原 高分子材料：硅膠、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯 無機玻璃基質(zhì) 常用商品化微載體有三種： Cytodex 3， Cytopore和Cytoline。適用于單克隆抗體、干擾素等的制備。最初使用醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成海綿狀多孔結(jié)構(gòu)。 生物反應(yīng)器應(yīng)用概況 * 動物細(xì)胞培養(yǎng)常用的生物反應(yīng)器： ? 柱狀中空纖維反應(yīng)器 ? 板框式中空纖維反應(yīng)器 ? 中心灌流式反應(yīng)器 ? 灌流微載體生物反應(yīng)器 ? 旋轉(zhuǎn)壁式反應(yīng)器 （三）動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)操作方式 優(yōu)點：操作簡單，培養(yǎng)周期短，污染和細(xì)胞突變的風(fēng)險小。 缺點：開放式操作，容易造成污染。 細(xì)胞形態(tài) 生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，在一般顯微鏡下觀察時透明度大，輪廓不清，只有用相差顯微鏡，才能看清細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)。因此生長與否尚不能作為判定細(xì)胞好壞的唯一標(biāo)準(zhǔn)，必須做全面分析。只有當(dāng)細(xì)胞分裂出現(xiàn)后，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，形成較大的生長暈或連接成片時，才真正進入了生長狀態(tài)。用磷酸鹽緩沖系統(tǒng)時，可因瓶口漏氣， CO2溢出，也可能由于培養(yǎng)瓶和瓶塞洗刷不潔殘留堿性物，使之變堿發(fā)紅。 1）細(xì)菌的污染及檢測 多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞在遭到細(xì)菌的污染后，培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象，可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮。在顯微鏡下可見絲狀細(xì)胞的交叉。 ? 相差顯微鏡檢測：將細(xì)胞接種于事先放置于培養(yǎng)瓶內(nèi)的蓋玻片上， 24h后取出，用相差油鏡觀察，支原體呈暗色微小顆粒位于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間； ? 熒光染色法：用能與 DNA特異性結(jié)合的熒光染料Hoechst33258，可使支原體內(nèi)含有的 DNA著色，染色后用熒光顯微鏡觀察。 ? 電鏡檢查：用掃描電鏡方法簡便快速，也可以利用透射電鏡。支原體代謝需固醇類物質(zhì)，部分種類需要精氨酸、 ?2或葡萄糖，每一種支原體都有自身特點。 ? 細(xì)胞交叉污染及檢測 ? 不容易發(fā)生，常見的細(xì)胞形態(tài)觀察可以區(qū)分。 ? 從蓋片邊緣滴加細(xì)胞懸液，使其充滿計數(shù)板和蓋片間的空隙中。如是非貼壁細(xì)胞，則離心棄舊培養(yǎng)基后，換上一定量的新鮮培養(yǎng)基然后制成細(xì)胞懸液計數(shù)。連續(xù)計數(shù) 7 d。再用酶標(biāo)儀測定 OD值 ? MTT法簡單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒牲試 ? 驗、腫瘤放射敏感性實驗等。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。它與生長曲線有一定的聯(lián)系，如隨著分裂指數(shù)的不斷提高，細(xì)胞也就進入了指數(shù)生長期。 ? 取出蓋片，按下列順序操作： 1） PBS漂洗 3分鐘 → 甲醇：冰醋酸 =3： 1固定液中固定 30分鐘 → Giemsa液染色 10分鐘 → 自來水沖洗。 ? 任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成 ， 從形態(tài)上區(qū)別死 、 活細(xì)胞是困難的 。 這種方法常用于抗癌藥物敏感性試驗 、腫瘤放射生物學(xué)試驗等 。 （ 4）細(xì)胞活力的計算 活細(xì)胞率 = 活細(xì)胞總數(shù) / （活細(xì)胞總數(shù) +死細(xì)胞總數(shù)） ? 100% （三）培養(yǎng)細(xì)胞種屬鑒定方法 熒光抗體染色鑒別細(xì)胞的種屬 ? 間接熒光抗體染色技術(shù) — 采用兔產(chǎn)生的特異性抗血清標(biāo)記待測細(xì)胞和陽性細(xì)胞、陰性細(xì)胞。該法有高度的可靠性，簡單、重復(fù)性好。 ? 染色體核型分析足以鑒定不同種間細(xì)胞系之間的污染。在倒置相差顯微鏡下觀察，著色的細(xì)胞為死亡細(xì)胞，視野下有較多細(xì)胞死亡為陽性。 ? 后來，口腔癌、喉癌、肺癌等細(xì)胞系相繼建立。 ? 培養(yǎng)成分上，由采用純血清培養(yǎng)到含血清培養(yǎng)基、再到無血清培養(yǎng)基三個階段。 ? 結(jié)果及鑒定 培養(yǎng)的細(xì)胞必須鑒定，以排除間充質(zhì)細(xì)胞混雜。在 75cm2培養(yǎng)瓶中接種5 106~105個即可，培養(yǎng) 3~4d可獲得 3~5 106個細(xì)胞，可再行胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)。 ? 肌肉組織培養(yǎng)：指將肌肉組織植塊或分散的肌肉細(xì)胞在離體條件下生存、生長或發(fā)育的技術(shù)。基本方法是取新生大鼠腦，切成小塊，用 HBSS胰酶消化， 37℃ 15min，將細(xì)胞懸液接種于聚 L—賴氨酸覆蓋內(nèi)底面的培養(yǎng)器皿內(nèi)進行培養(yǎng)。 （ 3）動物細(xì)胞培養(yǎng)基、培養(yǎng)設(shè)備以及培養(yǎng)用微載體昂貴。 細(xì)胞同步化培養(yǎng) 指自然或人工方法獲得細(xì)胞群體的細(xì)胞周期同步化生長。而器官保存無細(xì)胞增殖 ? （ 2）被培養(yǎng)物為一完整器官或具有完整功能的某一器官的一部分，如肝 ? （ 3）器官培養(yǎng)不能從一個變成多個，而細(xì)胞培養(yǎng)過程中有細(xì)胞量的增加 2 器官培養(yǎng)技術(shù) ? 器官培養(yǎng)可分為：胚胎器官培養(yǎng)和成年器官培養(yǎng) ? 培養(yǎng)原則：① 提供充足的氧氣和養(yǎng)料，及時排除廢物。 （ 10）搖擺式器官培養(yǎng)法 1976年，巴雷特（ Barret）創(chuàng)立 現(xiàn)代器官培養(yǎng) —— 灌流式器官培養(yǎng)法 ? 1938年，卡雷爾（ Carrel）和林德伯格（ Lindberg）嘗試 器官培養(yǎng)應(yīng)用舉例 ? （ 1）軟骨的培養(yǎng) ? （ 2）神經(jīng)組織的器官培養(yǎng) ? （ 3）血管的培養(yǎng) ? （ 4）肝臟的培養(yǎng) 最新進展 ? * 生物反應(yīng)器培養(yǎng)拇指指骨 ? * 在豬身上培育人體動脈 ? * 生物工程人造腎臟、乳腺、膀胱、 ? * 人造角膜 ? * 1996年，我國曹誼林教授培養(yǎng)出 “人耳”。 （ 7）瓊脂小島器官培養(yǎng)法 （ 8）陳氏濾紙虹吸器官培養(yǎng)法 1964年，陳瑞銘發(fā)明。 ? 1897年，利奧勃（ Leob）首創(chuàng)。 （ 5）在線監(jiān)控水平技術(shù)不完善，限制了優(yōu)良培養(yǎng)系統(tǒng)的開發(fā)。 ? 細(xì)胞培養(yǎng)目的與用途 1. 藥物研究與開發(fā) (1) 新藥篩選 :如化學(xué)合成藥物藥效研究 ,中藥有效成分篩選與鑒定等 . (2) 疫苗研究與開發(fā) :如病毒性疫苗的研究與開發(fā) (肝炎病毒疫苗 ,艾滋病疫苗等 ),腫瘤疫苗 (多肽疫苗 )等 . (3) 基因工程藥物研究與開發(fā) :如干擾素研究與開發(fā) ,細(xì)胞生長因子研究與開發(fā)等 . (4) 細(xì)胞工程藥物研究與開發(fā) :生物活性多肽研究與開發(fā) ,人參皂甙 ,紫杉醇等生物活性成分研究與開發(fā) . (5) 單克隆抗體制備 :包括診斷用單克隆抗體 ,治療用單克隆抗體 . 基礎(chǔ)研究 (1) 藥物作用機理 (2) 基因功能 (3) 疾病發(fā)生機理 2, 生物制藥 (1) 疫苗生產(chǎn) :如病毒性疫苗 (肝炎病毒疫苗 ,艾滋病疫苗等 ),腫瘤疫苗 (多肽疫苗 )等 . (2) 基因工程藥物生產(chǎn) :如在臨床醫(yī)學(xué)中具有治療價值的一些細(xì)胞生長因子如干擾素 ,粒細(xì)胞生長因子 ,胸腺肽等 (3) 診斷用和藥用單克隆抗體生產(chǎn) (4) 細(xì)胞工程藥物生產(chǎn) :生物細(xì)胞內(nèi)的一些生物活性多肽 ,生物活性物質(zhì)等 動物細(xì)胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀與展望 * 目前存在的主要問題 : （ 1）細(xì)胞密度低 ,產(chǎn)物濃度低。經(jīng)歷了組織塊培養(yǎng) →分離細(xì)胞培養(yǎng) →單一型細(xì)胞階段 神經(jīng)原細(xì)胞培養(yǎng) ? 神經(jīng)原細(xì)胞培養(yǎng)需要極高的營養(yǎng)條件，培養(yǎng)器皿也需要經(jīng)過特殊處理，神經(jīng)軸突在膠原和聚 L— 賴氨酸（ PolyLlysine）溶液中可以旺盛生長，神經(jīng)生長因子（ NGF）可促進神經(jīng)原的生長。 肌肉組織的體外培養(yǎng) ? （ 1）肌肉組織的特點 ? 肌肉組織（肌組織）細(xì)胞間結(jié)締組織少、血管和神經(jīng)豐富。培養(yǎng)初期可觀察到上皮細(xì)胞的纖維樣細(xì)胞混雜生長經(jīng)數(shù)次傳代后纖維樣細(xì)胞逐漸消失。 ? 國內(nèi)已建立的腫瘤細(xì)胞系主要有：來自白血病患者的淋巴樣的 J6懸浮生長型的胃癌 SL79上皮型的肝癌 SMMC772鼻咽癌 CNE成骨肉癌 OC861結(jié)腸癌 THC8910,以及多形型的胸膜間皮癌 SMC1等等。 發(fā)展成就 ? 在培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞類型上，經(jīng)歷了從間充質(zhì)源性的細(xì)胞轉(zhuǎn)上皮源性細(xì)胞、再由神經(jīng)外胚層源性到造血源性的發(fā)展歷程。 ? 腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)與建系過程 ? 上皮細(xì)胞培養(yǎng) ? 表皮組織培養(yǎng) ? 肌肉組織培養(yǎng) ? 神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng) 第四節(jié) 動物細(xì)胞體外培養(yǎng)舉例 腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)的歷史 ? 1906年， Beebe和 Ewing最早成功培養(yǎng)狗的淋巴肉瘤細(xì)胞； ? 1911年， Carrel最先在體外培養(yǎng)了纖維軟骨瘤及黑色素瘤細(xì)胞。 人主要組織相容性抗原 ? 人主要組織相容性抗原（ HLA抗原）存在大多數(shù)有核細(xì)胞膜上，常用抗原檢測是用補體依賴細(xì)胞毒試驗，用拒染來鑒定細(xì)胞活性。根據(jù)同種異體同工酶的表型和正常人群體的表型頻率資料，可以估計出一特定細(xì)胞系遺傳特征出現(xiàn)的頻率。后加上的熒光抗體將結(jié)合到已標(biāo)記有兔抗體的靶細(xì)胞上，借助熒光即可看到抗原－抗體復(fù)合物。 ? 缺點：操作繁瑣 ? 優(yōu)點：精確、可靠 臺盼藍(lán)法 ? 活細(xì)胞不被染色 ， 死細(xì)胞染成藍(lán)色 ， 用活細(xì)胞占 ? 細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力 ? 臺盼藍(lán)排斥試驗： （ 1）臺盼藍(lán)濃度： 母液： 4%，用雙蒸水配制；工作液：%，用 PBS稀釋?？寺⌒纬陕视脕肀硎炯?xì)胞的增殖能力 ? 克隆形成率＝克隆形成數(shù)／接種細(xì)胞數(shù) ， 通過計數(shù)克隆形成率 ， 可對單個細(xì)胞的增殖潛力作定量分析 ， 了解細(xì)胞的增殖率和對生存環(huán)境的適應(yīng)性 。 3） 計算 : 分裂