【正文】 養(yǎng)細(xì)胞的檢測和特性鑒定 一、培養(yǎng)細(xì)胞的常規(guī)檢查 細(xì)胞接種或傳代以后，在生存期間，實驗者每天或至多間隔 12天，要對細(xì)胞做常規(guī)性檢查 . 觀察的結(jié)果是：污染與否，細(xì)胞生長和 pH等情況，隨時掌握細(xì)胞動態(tài)變化，以便做換液或傳代處理，如發(fā)現(xiàn)異常情況應(yīng)及時采取措施。細(xì)胞機能不良時，輪廓增強，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物，細(xì)胞之間空隙加大，細(xì)胞形態(tài)可變得不規(guī)則甚至失去原有特點，如上皮細(xì)胞變成類纖維細(xì)胞等。在很多情況下，細(xì)胞雖機能狀態(tài)不良，但仍可生長，如支原體輕度污染時即如此。 細(xì)胞生長情況 ? 很多情況下，開始從組織最先“長”出的為游走細(xì)胞，它們單獨活動，形態(tài)不規(guī)則，用縮時逐格顯微電泳法可揭示出它們極活躍的變形、游走和吞噬活動。說細(xì)胞“生長”不如說移動更為恰當(dāng)，因這時尚很少見細(xì)胞分裂，僅有細(xì)胞運動而已。 培養(yǎng)液 在正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色。培養(yǎng)液中加 Hepes或用５％ CO2溫箱培養(yǎng)可使 PH維持穩(wěn)定。更換營養(yǎng)液時間，可依營養(yǎng)物的消耗而定，細(xì)胞生長旺盛時２－３天換一次，生長緩慢時，３－４天亦可。 污染的途徑 ?污染途徑 空氣、器材、操作、血清、組織樣品 ?污染對培養(yǎng)細(xì)胞的影響及檢測 體外培養(yǎng)細(xì)胞自身沒有抵抗污染的能力，而且培養(yǎng)基中加入的抗生素的抗污染能力也是有限的，因而培養(yǎng)細(xì)胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無法挽救 。 培養(yǎng)檢測，可以取少量培養(yǎng)液涂布在無菌瓊脂培養(yǎng)基上，過夜查看。 2）真菌的污染檢測 真菌的污染物通常是培養(yǎng)基表面漂浮的白色及黃色、黑色的小點。 防止，酒精棉球擦洗清除瓶口污染，必要時加入抗真菌劑。支原體污染后的培養(yǎng)細(xì)胞中沒有明顯可見的特征，所以很難發(fā)現(xiàn)。具體方法如下：首先將細(xì)胞接種蓋玻片上，在細(xì)胞未長滿前取出玻片，用不含酚紅的 Hanks液漂洗一下，用 1： 3醋酸甲醇固定 10min，然后用生理鹽水漂洗，置于用生理鹽水配置濃度為 50?g/ml的 Hoechst33258中染色10min。鏡下支原體為散在于細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞膜表面的亮綠色小點。 ? 鏡下觀察支原體膜為三層結(jié)構(gòu)，其中央有電子密度大的密度顆粒群或絲狀的中心束。橫斷面與細(xì)胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無顆粒群或中央束。 ? DNA分子雜交檢查或支原體培養(yǎng)等方法：檢出率高，但方法較復(fù)雜。通常其檢測方式是抗體檢測及 PCR檢測。 污染的預(yù)防 ? 培養(yǎng)前 培養(yǎng)操作時 其他注意事項 必要的細(xì)胞備份 對新引進或構(gòu)建的細(xì)胞株應(yīng)加強觀察，并做必要的支原體和病毒的檢查。 二、培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)鑒定 細(xì)胞形態(tài)觀察 內(nèi)容：細(xì)胞形態(tài)、核質(zhì)比例、染色質(zhì)、核仁大小及多少、微絲微管排列狀態(tài)等 方法：倒置相差顯微鏡、電鏡 細(xì)胞生長情況 ?細(xì)胞生長曲線測定 1）、細(xì)胞計數(shù)法 ?血細(xì)胞計數(shù)器：人工計數(shù)細(xì)胞 ?Counter計數(shù)儀 ? 用酒精沖洗計數(shù)板后擦凈，將蓋片覆在計算板上，微微移向一側(cè)， 以便滴加細(xì)胞懸液 . ? 取一吸管伸入培養(yǎng)瓶，輕輕吹打細(xì)胞懸液，混勻。 ? 注意：勿使液體漫過蓋片或出現(xiàn)氣泡。 步驟 ? 取生長良好接近匯合的細(xì)胞，用胰酶消化，用新培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液后計數(shù)。 ? 根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果按每個小方瓶 5 104／ mL作傳代培養(yǎng)接種細(xì)胞，共接種 21瓶細(xì)胞。計算平均值。 ? 根據(jù)細(xì)胞計數(shù)結(jié)果，以單位細(xì)胞數(shù) (細(xì)胞數(shù)／ mL)為縱坐標(biāo)，以時間為橫坐標(biāo)繪制生長曲線。二甲亞砜（ DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的 formazan量成正比。 ? 操作步驟 （ 1）單細(xì)胞懸液接種于 96孔培養(yǎng)板； 103104細(xì)胞 /孔，每孔培養(yǎng)基總量 200微升（ 96孔培養(yǎng)板每孔容積 370微升）， 37℃ 、 5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間（根據(jù)實驗?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時間） （ 2）加入 2毫克／毫升的 MTT液（ 50微升／孔）；繼續(xù)培養(yǎng) 3小時。 （ 4）酶標(biāo)儀在 490nm處檢測各孔OD值記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長曲線 CCK8試劑盒 ? 原理： ? Cell Counting Kit8（ CCK8試劑盒）是檢一種基于水溶性四唑鹽的廣泛應(yīng)用快速高靈敏度檢測試劑盒，為 MTT法的替代方法，試劑盒中采用水溶性四唑鹽在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan。對于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈良好線性關(guān)系。 細(xì)胞分裂指數(shù) ?體外培養(yǎng)細(xì)胞生長、分裂繁殖的能力，可用分裂指數(shù)來表示。 ? 分裂指數(shù)指細(xì)胞群體中分裂細(xì)胞所占的百分比，它是測定細(xì)胞周期的一個重要指標(biāo)，也是不同實驗研究選擇細(xì)胞的重要依據(jù)。 ? CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48小時，使細(xì)胞長在蓋片上。 2）蓋片晾干后反扣在載玻片上，鏡檢。 （ 2）流式細(xì)胞儀測定法 培養(yǎng)細(xì)胞活力測定 ? 細(xì)胞活力測定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。 1 、細(xì)胞克隆形成率實驗 克隆形成試驗是測定單個細(xì)胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是單個細(xì)胞在體外增殖 6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體形成肉眼可見的克隆。克隆形成率高者其獨立生存能力強 。 常用的方法有平板克隆形成試驗和軟瓊脂克隆形成試驗 。 （ 2）稀釋倍數(shù)： 臺盼藍工作液：細(xì)胞懸液 = 1： 9 （ 3）結(jié)果判斷： 鏡下觀察見死細(xì)胞被染成淡蘭色，活細(xì)胞不著色。加標(biāo)記有熒光染料（ FITC）的山羊抗兔免疫球蛋白抗體。 同工酶譜系鑒別細(xì)胞種屬 ? 通過確定三種同工酶系統(tǒng)（ 6磷酸葡萄糖脫氫酶（ G6PD），乳酸脫氫酶（ LDH）和核苷磷酸化酶（ NP）的垂直淀粉膠電泳的遷移率，可以鑒定細(xì)胞系的種屬來源。利用同工酶分析檢驗細(xì)胞的交叉污染 ? G6PD、 LDH、 NP的電泳遷移率差異不僅可用來鑒別細(xì)胞系所屬種屬，還可查出種內(nèi)細(xì)胞的交叉污染。 染色體分析 ? 多數(shù)情況下，即使普通顯微鏡觀察技術(shù)，液足以鑒定不同種的染色體結(jié)構(gòu)的差異。親緣關(guān)系近的靈長類細(xì)胞系之間和人癌細(xì)胞系之間的比較可用 Giemsa顯帶分析。 原理： HLA抗體與淋巴細(xì)胞表面的相應(yīng)抗原結(jié)合后激活補體，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，通透性增強，染料進入細(xì)胞，細(xì)胞死亡。 核酸技術(shù) 用重組 DNA技術(shù)和 DNA探針技術(shù)鑒定和定量培養(yǎng)細(xì)胞中等位基因的多態(tài)性。 ? 1952年， Gey首先成功地建立了世界上第一個細(xì)胞系 —— 來源于子宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞系，并且是惡性腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)從間葉組織源性的細(xì)胞轉(zhuǎn)向上皮源性細(xì)胞。迄今為止，全球范圍內(nèi)建立的細(xì)胞系目前已經(jīng)超過三位數(shù)。 ? 在培養(yǎng)方法上，經(jīng)歷了從原代培養(yǎng)到傳代培養(yǎng)、再到細(xì)胞系的建立的發(fā)展過程。 ? 在對體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性研究水平上，經(jīng)歷了從細(xì)胞水平到亞細(xì)胞水平，再到酶和分子水平的發(fā)展時期。 上皮組織的體外培養(yǎng) ? 體外培養(yǎng)細(xì)胞生長的形態(tài)特性 細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞形態(tài)較為一致，細(xì)胞間質(zhì)少 上皮組織的體外培養(yǎng)特性：依賴性、接觸抑制性、細(xì)胞連接、貼壁生長 表皮組織的體外培養(yǎng) ? * 表皮細(xì)胞分兩類： ? 角質(zhì)形成細(xì)胞、非角質(zhì)形成細(xì)胞 ? * 角質(zhì)形成細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)： ? 1975年，萊因沃德（ Rheinwald）和格林（ Green）創(chuàng)立飼養(yǎng)層培養(yǎng)法 ? 上皮細(xì)胞培養(yǎng)液：近年來，國外一些公司研制了多種成品上皮細(xì)胞培養(yǎng)液，例如適用于角化上皮細(xì)胞的 KGM，適用于一般表皮細(xì)胞的 EGM等，使用很方便。表皮細(xì)胞對角蛋白特異性單克隆抗體反應(yīng)陽性，間充質(zhì)細(xì)胞對波型絲特異性單克隆抗體反應(yīng)陽性。 ? 【 3T3細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)和照射處理 】 3T3細(xì)胞是 Swiss鼠成纖維細(xì)胞，在表皮細(xì)胞培養(yǎng)中經(jīng)常用照射處理過的 3T3細(xì)胞作滋養(yǎng)層， 3T3細(xì)胞一般應(yīng)維持在低密度條件下培養(yǎng)。如果用于照射處理，將胰蛋白酶消化的細(xì)胞懸浮于含 10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液中，在 75cm2培養(yǎng)瓶中接種 106個細(xì)胞，在鈷源下給予 60Gy（ 6,000rads）照射劑量，培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁，更換培養(yǎng)液，待用。肌細(xì)胞長梭形，又稱肌纖維。 ? （ 2）骨骼肌的培養(yǎng) 神經(jīng)組織的體外培養(yǎng) ? 神經(jīng)組織包括：神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 ? 1907年，哈里森首創(chuàng)培養(yǎng)方法。 ? 從出生 4~8d的大鼠腦組織取材培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入胞嘧啶阿拉伯糖抑制非神經(jīng)原細(xì)胞，可獲得特征明顯的腦神經(jīng)細(xì)胞。 【 用品 】 ? DMEM培養(yǎng)液：其中加有 10%熱滅胎牛血清， 30m mol/L葡萄糖，— 谷氨酰胺， mol/L KCL， 100mU/L胰島素，7μmol/L P— 氨基苯酸， 100μg/ml慶大霉素 ? Hands 平衡鹽液，其中加入牛血清白蛋白 3g/L (HBSS) ? 聚 L— 賴氨酸，分子量大于 300,00 ? 胞嘧啶阿拉伯糖 ? Ⅱ 型胰蛋白酶（ %，溶于 HBSS） ? 硅膠（ Aquasil, Pierce 42799） ? ， Pasteur滴管， 10ml移液器（無菌） ? 12ml和 50ml無菌試管、無菌手術(shù)器械、水浴箱 【 鑒定方法 】 ? 用神經(jīng)原特異性烯醇抗體或破傷風(fēng)毒素作為標(biāo)記物，經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測可判定神經(jīng)原細(xì)胞；用膠質(zhì)原纖維酸性蛋白作為標(biāo)記物可判斷混雜在其中的膠質(zhì)細(xì)胞。 （ 2）細(xì)胞群體在大規(guī)模 ,長時間培養(yǎng)過程中分泌產(chǎn)物能力易丟失 ,或產(chǎn)物活性易降低。 （ 4）目前對細(xì)胞代謝和生長動力學(xué)的研究比較欠缺。 第五節(jié) 細(xì)胞同步化 細(xì)胞同步化培養(yǎng) 指自然或人工方法獲得細(xì)胞群體的細(xì)胞周期同步化生長。 篩選同步化細(xì)胞 誘導(dǎo)同步化細(xì)胞 M期細(xì)胞震蕩脫落法 離心洗脫法 梯度沉降法 血清饑餓法 異亮氨酸營養(yǎng)缺乏法 DNA合成抑制劑阻斷法 秋水仙素阻斷法 第六節(jié) 器官培養(yǎng) ? 定義與特點 ? 器官培養(yǎng)技術(shù) 1 定義與特點 ? 器官培養(yǎng)：取出動物器官或進一步修整成器官型植塊，將其培養(yǎng)使其存活和生長的過程。 人體器官培養(yǎng)的共同點： ? （ 1）培養(yǎng)對象為胚胎組織的某一器官或非胚胎組織器官的一部分 ? （ 2）被培養(yǎng)對象浸泡在培養(yǎng)液中 ? （ 3）培養(yǎng)器官從培養(yǎng)液中獲氧及養(yǎng)料，同時排廢物 器官培養(yǎng)特征 ? （ 1）被培養(yǎng)的器官在體外存活較長時間，并保存相對正常的功能，器官內(nèi)的細(xì)胞有正常的代謝甚至增殖。② 抑制細(xì)胞從植塊向外遷移 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法 （ 1）表玻璃器官培養(yǎng)法 ? 1929年，費爾（ Fell）和魯濱遜 （ Robinson）建立 （ 2）瓊脂凝膠培養(yǎng)法 ?沃爾夫（ Wolff）和施奈德（ Schneider） （ 3）懸浮培養(yǎng)法 （ 4）直接漂浮培養(yǎng)法 ? 1948年，梅達沃（ Medawar）設(shè)計 （ 5）擦鏡紙培養(yǎng)法 （ 6）金屬格柵器官培養(yǎng)法 1954年，特羅爾（ Trowell）創(chuàng)立。 （ 9）旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 1933年，蓋爾（ Gey）建立。