動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)小鼠脾臟細(xì)胞docxdocx-閱讀頁(yè)
2025-08-01 18:07本頁(yè)面
【正文】 調(diào)亡小體,形成DNA電泳的梯狀帶。陳潔等通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明竹紅菌甲素(hypocrellinHA)能夠誘導(dǎo)人黑色素瘤(A23752S2)細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)亡,并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在S期。誘導(dǎo)分化治療是指通過(guò)藥物誘導(dǎo),使腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化,同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞無(wú)殺傷作用,并且很少有骨髓抑制等誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化及逆轉(zhuǎn)是當(dāng)前腫瘤分子生物學(xué)中一個(gè)重要的研究領(lǐng)域。錢(qián)軍等在研究欖香烯乳對(duì)體外培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞株超微結(jié)構(gòu)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組癌細(xì)胞給藥后出現(xiàn)表面微絨毛減少,細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)比例下降,核周邊光滑,切跡淺,核仁常為單個(gè),常染色質(zhì)減少,異染色質(zhì)增多等現(xiàn)象。上述表現(xiàn)提示欖香烯乳在30μgCHEN等報(bào)道茯苓中的多糖片段可使66.4%人早幼粒白血病HL260細(xì)胞誘導(dǎo)分化成為成熟的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,使其表現(xiàn)出正常的生理功能并且表達(dá)標(biāo)志性表面抗原CD11b、CD68和CD14近年來(lái),許多天然抗由于腫瘤本身是一種多基因的疾病,目前腫瘤的治療仍是2. 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的藥物篩選方法：（1） 可以利用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞光散射可對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行分析，凋亡早期細(xì)胞因體積減小，胞漿及染色質(zhì)固縮，F(xiàn)SC變小，SSC增大，凋亡晚期細(xì)胞FSC，SSC均變?。挥昧魇郊?xì)胞儀也可以根據(jù)DNA含量不同，從細(xì)胞群體中鑒別出凋亡細(xì)胞；另外，細(xì)胞凋亡受基因調(diào)控，有賴(lài)于某些蛋白質(zhì)的合成，用流式細(xì)胞儀可同時(shí)檢測(cè)出凋亡細(xì)胞的FSC/SSC及DNA/蛋白質(zhì)，進(jìn)行多參數(shù)分析以研究不同的凋亡誘導(dǎo)作用機(jī)制。（2） 化療是腫瘤治療的一種重要方法，新的抗腫瘤藥物也不斷地涌現(xiàn)。本研究選用米托蒽醌、順鉑、羥基喜樹(shù)堿、 高三尖杉酯堿誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡，并通過(guò)Annexin V /PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞死亡比例，分析不同作用時(shí)間以及不同藥物濃度對(duì)Jurkat細(xì)胞凋亡的影響。順鉑（CDDP）為齊魯制藥有限公司產(chǎn)品、羥基喜樹(shù)堿（HCPT）為黃石飛云制藥廠產(chǎn)品、 高三尖杉酯堿（HHT）為杭州民生藥業(yè)公司產(chǎn)品、米托蒽醌（MIT）為浙江瑞新藥業(yè)公司產(chǎn)品；RPMI 1640為Invitrgen產(chǎn)品；Annexin V FITC/PI試劑盒購(gòu)自晶美生物公司；貝克曼流式細(xì)胞分析儀 Elite EXP。用無(wú)血清細(xì)胞懸液將順鉑、 羥基喜樹(shù)堿、高三尖杉酯堿和米托蒽醌藥物配制成1 mg/ml溶液；每組藥物分別設(shè)4個(gè)濃度：、250、100 μg/ml；分別加入24孔培養(yǎng)板，作3個(gè)復(fù)孔?！ nnexin V/PI流式雙參數(shù)分析［13］ 分別于加入藥物作用4和8小時(shí)，吸取培養(yǎng)細(xì)胞懸液，用4℃預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次，用250 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，使其濃度為1106/ml；取100 μl細(xì)胞懸液，加5 μlAnnexin V/FITC和10 μl 的碘化丙錠；混勻后室溫避光孵育15分鐘；用PBS洗滌2次，進(jìn)行流式細(xì)胞儀（FACS）分析。圖15橫坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)，圖中兩個(gè)峰中的左邊峰表示陰性峰，右峰表示凋亡峰，右峰曲線下面積越大凋亡就越多?！ 〗y(tǒng)計(jì)學(xué)分析 各組細(xì)胞凋亡率均取3個(gè)樣本的均值，以X177。醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)》統(tǒng)計(jì)軟件包 PEMS 。目前，細(xì)胞凍存最常用的技術(shù)是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護(hù)劑的緩慢冷凍法凍存細(xì)胞。如細(xì)胞脫水使局部電解質(zhì)濃度增高，pH值改變，部分蛋白質(zhì)由于上述原因而變性，引起細(xì)胞內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)紊亂，溶酶體膜由此遭到損傷而釋放出溶酶體酶，使細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)成分造成破壞，線粒體腫脹，功能丟失，并造成能量代謝障礙。如果細(xì)胞內(nèi)冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成細(xì)胞核DNA空間構(gòu)型發(fā)生不可逆的損傷，而致細(xì)胞死亡。采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可以使冰點(diǎn)下降，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，且對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性。將多個(gè)培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液去掉，% 胰蛋白酶消化。用吸管吸取培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，使其成為均勻分散的細(xì)胞懸液。然后將細(xì)胞收集于離心管中離心(1000r/min，10分鐘)。（3）將上述細(xì)胞分裝于安瓿或?qū)Ｓ美鋬鏊芰瞎苤校碴逞b1～，封口處要完全封閉，圓滑無(wú)勾。（4）將裝好細(xì)胞的安瓿或凍存管裝入沙布袋內(nèi)；置于液氮容器頸口處存放過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)入液氮中。細(xì)胞凍存在液氮中可以長(zhǎng)期保存，但為妥善起見(jiàn)，凍存半年后，最好取出一只安瓿細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況，然后再繼續(xù)凍存。在實(shí)際操作中，凍存細(xì)胞要進(jìn)行復(fù)蘇，再培養(yǎng)傳代。以保證細(xì)胞外結(jié)晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細(xì)胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細(xì)胞主要操作步驟是：（1）佩戴眼鏡和手套，從液氮罐中取出安瓿或冷凍管。（3）在1000r/min速度下離心5～10分鐘，棄去上層液，加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中，接種濃度1109/L，置37℃溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況?；驘o(wú)需離心直接將細(xì)胞加入瓶中，并加入培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)12～24小時(shí)后，充去上清，換入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。裝運(yùn)方法有兩種，一種是冷凍儲(chǔ)存運(yùn)輸法，包括干冰運(yùn)輸和液氮運(yùn)輸，需要用特殊容器，保存效果較好，但較麻煩，且液氮和干冰蒸發(fā)都較快，不適于長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行，需要空運(yùn)。具體方法如下：空氣留量過(guò)多，運(yùn)輸時(shí)大氣泡來(lái)回流動(dòng)對(duì)細(xì)胞有干擾作用。②一般在4～5天內(nèi)到達(dá)目的地，對(duì)細(xì)胞活力無(wú)多大影響，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則細(xì)胞活力下降。③ 到達(dá)目的地后，倒出大部分培養(yǎng)液，保留維持細(xì)胞生長(zhǎng)所需的液量，置37℃培養(yǎng)，次日傳代
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