【正文】 規(guī)模培養(yǎng)操作方式 優(yōu)點：操作簡單，培養(yǎng)周期短，污染和細胞突變的風(fēng)險小。 ? 目前材料有：硅膠、聚丙烯等。最初使用醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成海綿狀多孔結(jié)構(gòu)。 ? 制備中應(yīng)注意： ? 溫和、快速、不損傷細胞，盡量在液體和生理條件下操作； ? 所用試劑和膜材料對細胞無毒害； ? 膜的孔徑可控制，必須使營養(yǎng)物和代謝物自由通過； ? 膜應(yīng)有足夠機械強度抵抗培養(yǎng)中攪拌。適用于單克隆抗體、干擾素等的制備。適用于貼壁細胞培養(yǎng)、懸浮細胞固定化連續(xù)灌流培養(yǎng)和大規(guī)模高密度培養(yǎng)系統(tǒng)。 微載體系統(tǒng)培養(yǎng)細胞具體步驟 p110 選擇合適的微載體類型 浸泡水化及消毒 接種 培養(yǎng)觀察和細胞計數(shù) 消化 分離細胞 傳代培養(yǎng) 交聯(lián)葡萄糖 DEAE纖維素 蛋白質(zhì)：變性膠原 高分子材料：硅膠、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯 無機玻璃基質(zhì) 常用商品化微載體有三種： Cytodex 3， Cytopore和Cytoline。 ? 原理：其原理是將對細胞無害的顆粒 微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細胞在微載體表面附著生長，同時通過持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。 （一）培養(yǎng)方法 ? 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng) ? 反應(yīng)器貼壁培養(yǎng) ? 懸浮培養(yǎng)技術(shù) ? 微載體培養(yǎng)技術(shù) ? 多孔載體培養(yǎng) ? 微囊化培養(yǎng)技術(shù) ? 中空纖維法 固定化培養(yǎng) 反應(yīng)器貼壁培養(yǎng) ? 此種培養(yǎng)方式中，細胞貼附于固定的表面生長，不因為攪拌而跟隨培養(yǎng)液一起流動，因此比較容易更換培養(yǎng)液，不需要特殊的分離細胞和培養(yǎng)液的設(shè)備，可以采用灌流培養(yǎng)獲得高細胞密度，能有效地獲得一種產(chǎn)品；但擴大規(guī)模較難，不能直接監(jiān)控細胞的生長情況，故多用于 制備用量較小、價值高的生物藥品。 ? 一般是一次性使用 克隆培養(yǎng)法 就是將細胞懸液中獲得的單個細胞用于培養(yǎng)，使之重新繁殖成一個新的細胞群體的培養(yǎng)技術(shù) 過程 : 制細胞懸液 連續(xù)稀釋獲得單細胞 單細胞接種 培養(yǎng) 細胞株 :由細胞系進一步克隆化，而獲得的由單一細胞形成的細胞群體。 ? 優(yōu)點： 1）可以避免培養(yǎng)瓶表面粗糙等原因?qū)ε囵B(yǎng)物的影響 2）可以方便顯微觀察、染色等操作，以及永久保存； 3）增加了培養(yǎng)瓶培養(yǎng)面積。采用的材料對細胞無毒，透明。 ? 1923年，卡雷爾（ Carrel）設(shè)計了卡氏瓶。 1912年由Burrows首創(chuàng)。 ? 缺點：不易在顯微鏡下觀察。 ? 特點：是培養(yǎng)中組織塊或細胞交替地與培養(yǎng)液和空氣直接接觸。 2）培養(yǎng)物在培養(yǎng)過程中，不需移動位置，有利于組織分化。即將組織或器官植塊接種在一張蓋玻片上，滴上一滴培養(yǎng)液，然后翻轉(zhuǎn)蓋玻片使植塊及營養(yǎng)液懸掛于蓋玻片下，再置于一凹形載玻片上，最后用熔蠟密封后放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 （ 4） 去上清 ， 加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細胞 。 （ 2） 5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的 10倍以上 。 5）使用高濃度血清 細胞復(fù)蘇方法 ? 與快速融化的手段 ， 以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)融化 ， 避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損害 。適用于懸浮型細胞與 hybridoma之保存。 20℃ 不可超過 1小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入 80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 細胞凍存方法 1預(yù)先配制凍存液： 含 20%血清培養(yǎng)基 9份 DMSO 1份 2 取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液 , 用吸管吹打制成細胞懸液（ 1 106 ～ 5 106細胞 /ml) 3 分裝：每瓶 1ml，密封后標記冷凍細胞名 稱和冷凍日期。 ? 保護劑的濃度在 5~15%之間，常用 10%。 保存細胞三要素：營養(yǎng)、保護劑和低溫 低溫保護劑的應(yīng)用 ? 在細胞凍存時加入保護劑，能大大提高凍存效果。 ? 如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。 凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融 ? 當細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。 （三）細胞純化 （四）細胞的凍存復(fù)蘇 ?細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規(guī)工作。 基本步驟： 吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液 ↓ 加入胰蛋白酶和 EDTA混和液 (以能覆蓋整個瓶底為準） ↓ 吸出消化液，加入培養(yǎng)液終止消化 ↓ 吸管輕輕吹打使細胞分散成懸液，計數(shù) ↓ 重新接種 于新的培養(yǎng)瓶內(nèi) 1）貼壁生長細胞傳代 ↓ 培養(yǎng) 2）懸浮生長細胞傳代 離心法傳代 直接傳代法 離心法傳代：離心（ 1000轉(zhuǎn) /分 800g）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。 ? 第一次傳代時間 ： 有 8090%或剛剛?cè)繀R合的細胞是傳代的理想時期。 ? 一般而言幼體組織比老齡組織，分化低的比分化高，腫瘤組織比正常組織易于培養(yǎng)。 第二節(jié) 動物細胞、組織培養(yǎng)的方法 一、體外培養(yǎng)的一般過程 二、動物細胞培養(yǎng)的基本方法 三、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 四、動物細胞體外培養(yǎng)舉例 五、動物細胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀與展望 一、體外培養(yǎng)的一般過程 ?體外細胞培養(yǎng)一般過程： 組織獲得 → 組織消化 → 接種 →培養(yǎng) →傳代及細胞凍存復(fù)蘇等 動物胚胎或幼齡動物的組織、器官 細胞懸液 胰蛋白酶 1代細胞 原代培養(yǎng) 50代細胞 傳代培養(yǎng) 無限傳代 單個細胞 加培養(yǎng)液 動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細胞網(wǎng)絡(luò)起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。若及時分離培養(yǎng)、進行傳代，將細胞分開接種至新的培養(yǎng)器皿并補充以新鮮培養(yǎng)液，細胞將于培養(yǎng)器皿中成為下一代的細胞而再次繁殖。 ? 此期細胞生長的底物面積已被生長的細胞所占滿，細胞量和密度達到飽和，細胞停細胞雖尚有活力但已不再分裂增殖，細胞數(shù)量持平。細胞不再繁殖而進入平臺期。細胞將接觸而連成一片，漸次鋪滿培養(yǎng)器皿底物，提供細胞生長的區(qū)域逐漸減少甚至消失。 ? 細胞生長增殖狀況可以細胞群體倍增時間及細胞分裂指數(shù)等來判斷。 傳代 1）潛伏期 2） 指數(shù)生長期 ? 細胞增殖旺盛，成倍增長，活力最佳，適用于進行實驗研究。 細胞”一代”：僅指從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一 段時間。失去接觸抑制。 (3)衰退期，此期細胞雖仍存活，但增殖基本停止，細胞形態(tài)輪廓增強，進而細胞發(fā)生衰退、死亡。 ? 永久細胞系有如下特征：細胞形態(tài)變化，如細胞變小，黏附性減少，具有較高的核質(zhì)比；生長速率增加，倍增時間縮短；對血清的依賴性減?。毁N壁依賴性降低；細胞異倍體和非整倍體增加，細胞接種到體內(nèi)后，生癌率上升。 ? 大多數(shù)細胞系在有限的代數(shù)內(nèi)以不變的形式增殖，當超過有限世代后 ，它們可能有兩種情況，一是衰老死亡，二是發(fā)育成永久細胞系或稱連續(xù)細胞系。即使提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)（包括血清），最終也會死亡。經(jīng)繼代培養(yǎng)后即成為有限細胞系 (finite cell line)。 細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，被稱為二倍體核型。 (2)傳代期 ? 當細胞持續(xù)生長增殖一段時間，達到一定的細胞密度后，就應(yīng)當將細胞分離成兩部分（或更多）至新的培養(yǎng)器皿中，并補充更新培養(yǎng)液，此即為傳代。 細胞的分裂周期長 細胞分裂時間為 12～ 48h， 細胞的分裂 周期 =間期 +分裂期 間期（ G1+S+G2） 分裂期（ M） 體外培養(yǎng)細胞壽命的過程可分為三個階段 原代培養(yǎng)期 傳代期 衰退期 細胞系的生長過程： (1)原代培養(yǎng)（初代培養(yǎng)） ? 為新鮮組織自體內(nèi)取出接種培養(yǎng)至第一次傳代的階段 ,一般持續(xù) 1~4周。 ? 轉(zhuǎn)化細胞或惡性腫瘤細胞則與正常細胞不同，他們的密度依賴性調(diào)節(jié)常常降低，因而可以生長至較高的終末細胞密度。其確切的細胞密度常與培養(yǎng)液中的血清濃度有關(guān)。 ? 一般的正常細胞并不互相重疊于其上面而生長；但是，轉(zhuǎn)化細胞或癌瘤細胞則接觸抑制下降，他們互相之間可在上面或下面經(jīng)過而重疊生長。 ? 細胞貼附和伸展過程： 貼附過程：促細胞附著因子吸附于底物上 懸浮的圓形細胞與底物附著 細胞將伸展成其原來的形態(tài) 。一類特殊的促細胞附著的物質(zhì)（如基膜素、纖維連接素、 Ⅲ型膠原、血清擴展因子等）可能參加細胞的貼附過程。 (二）培養(yǎng)細胞的生長特點 貼附和伸展 接觸抑制 密度抑制 1．貼附 貼附并伸展，是多數(shù)體外培養(yǎng)細胞的基本生長特點。 ?影響細胞形態(tài)學(xué)特征的因素 血清成分、培養(yǎng)基成分、添加成分、培養(yǎng)基的酸堿度、氣相環(huán)境、溫度等。 ? 缺點是不如貼附生長型觀察方便，而且并非所有的培養(yǎng)細胞都能懸浮生長。 ? 這種細胞的形態(tài)特點：胞體始終為球形。 ? 見于少數(shù)特殊的細胞，如血液白細胞、淋巴組織細胞、雜交瘤細胞轉(zhuǎn)化細胞系、某些類型的癌細胞及白血病細胞。如神經(jīng)組織細胞如神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞等。 細胞內(nèi)易出現(xiàn)色暗的吞噬性顆粒。 單 核 巨 噬 細 胞 游走型細胞在支持物上分散生長，一般不連接成片、形成群落； 細胞胞質(zhì)常伸出偽足和突起。 ? 體外培養(yǎng)的游走型細胞具有類似巨噬細胞樣的特征。在一定的條件下，由于細胞密度增大聯(lián)成片后，可呈類似多角型或成纖維細胞形態(tài)。細胞質(zhì)經(jīng)常伸出 偽足或突起，呈活躍的游走或變形運動，速度快且不規(guī)則。 （ 3）游走型細胞： ? 不常見，具有類似巨噬細胞樣的特征。與這兩種形態(tài)類似的細胞，可能來自不同性質(zhì)的細胞亞類。 ? Hela細胞呈現(xiàn)為典型的上皮細胞型 。 ? 內(nèi)胚層和外胚層細胞體外培養(yǎng)時都可能呈現(xiàn)上皮型。 ? 細胞貼壁后呈不規(guī)則多角形，中央有 扁 圓形核，細胞彼此緊密相連成單層 細胞，呈現(xiàn) “ 鋪路石狀 ” 。 ? 人胚肺細胞在顯微鏡下呈現(xiàn)為典型的成纖維細胞型。 人的成纖維細胞 小鼠的成纖維細胞 人骨髓間充質(zhì)細胞（ MSC） 大鼠血管平滑肌細胞 成纖維細胞型 ?成纖維型細胞 在培養(yǎng)中的細胞凡形態(tài)與成纖維細胞類似時，皆可稱之為成纖維細胞。 其生長特點為細胞一般并不緊靠相連； 中胚層細胞體外培養(yǎng)時一般表現(xiàn)為這一形式。 ? 單層附壁培養(yǎng)：指動物細胞培養(yǎng)中，大多細胞必須附著在固體表面生長，當細胞布滿表面后即停止生長。因此在