【正文】 （ 10）搖擺式器官培養(yǎng)法 1976年，巴雷特（ Barret）創(chuàng)立 現代器官培養(yǎng) —— 灌流式器官培養(yǎng)法 ? 1938年，卡雷爾（ Carrel）和林德伯格（ Lindberg）嘗試 器官培養(yǎng)應用舉例 ? （ 1）軟骨的培養(yǎng) ? （ 2）神經組織的器官培養(yǎng) ? （ 3）血管的培養(yǎng) ? （ 4）肝臟的培養(yǎng) 最新進展 ? * 生物反應器培養(yǎng)拇指指骨 ? * 在豬身上培育人體動脈 ? * 生物工程人造腎臟、乳腺、膀胱、 ? * 人造角膜 ? * 1996年，我國曹誼林教授培養(yǎng)出 “人耳”。 （ 7）瓊脂小島器官培養(yǎng)法 （ 8）陳氏濾紙虹吸器官培養(yǎng)法 1964年，陳瑞銘發(fā)明。而器官保存無細胞增殖 ? （ 2）被培養(yǎng)物為一完整器官或具有完整功能的某一器官的一部分，如肝 ? （ 3）器官培養(yǎng)不能從一個變成多個，而細胞培養(yǎng)過程中有細胞量的增加 2 器官培養(yǎng)技術 ? 器官培養(yǎng)可分為：胚胎器官培養(yǎng)和成年器官培養(yǎng) ? 培養(yǎng)原則：① 提供充足的氧氣和養(yǎng)料，及時排除廢物。 ? 1897年，利奧勃（ Leob）首創(chuàng)。 細胞同步化培養(yǎng) 指自然或人工方法獲得細胞群體的細胞周期同步化生長。 （ 5）在線監(jiān)控水平技術不完善，限制了優(yōu)良培養(yǎng)系統(tǒng)的開發(fā)。 （ 3）動物細胞培養(yǎng)基、培養(yǎng)設備以及培養(yǎng)用微載體昂貴。 ? 細胞培養(yǎng)目的與用途 1. 藥物研究與開發(fā) (1) 新藥篩選 :如化學合成藥物藥效研究 ,中藥有效成分篩選與鑒定等 . (2) 疫苗研究與開發(fā) :如病毒性疫苗的研究與開發(fā) (肝炎病毒疫苗 ,艾滋病疫苗等 ),腫瘤疫苗 (多肽疫苗 )等 . (3) 基因工程藥物研究與開發(fā) :如干擾素研究與開發(fā) ,細胞生長因子研究與開發(fā)等 . (4) 細胞工程藥物研究與開發(fā) :生物活性多肽研究與開發(fā) ,人參皂甙 ,紫杉醇等生物活性成分研究與開發(fā) . (5) 單克隆抗體制備 :包括診斷用單克隆抗體 ,治療用單克隆抗體 . 基礎研究 (1) 藥物作用機理 (2) 基因功能 (3) 疾病發(fā)生機理 2, 生物制藥 (1) 疫苗生產 :如病毒性疫苗 (肝炎病毒疫苗 ,艾滋病疫苗等 ),腫瘤疫苗 (多肽疫苗 )等 . (2) 基因工程藥物生產 :如在臨床醫(yī)學中具有治療價值的一些細胞生長因子如干擾素 ,粒細胞生長因子 ,胸腺肽等 (3) 診斷用和藥用單克隆抗體生產 (4) 細胞工程藥物生產 :生物細胞內的一些生物活性多肽 ,生物活性物質等 動物細胞體外培養(yǎng)現狀與展望 * 目前存在的主要問題 : （ 1）細胞密度低 ,產物濃度低?；痉椒ㄊ侨⌒律笫竽X，切成小塊，用 HBSS胰酶消化， 37℃ 15min，將細胞懸液接種于聚 L—賴氨酸覆蓋內底面的培養(yǎng)器皿內進行培養(yǎng)。經歷了組織塊培養(yǎng) →分離細胞培養(yǎng) →單一型細胞階段 神經原細胞培養(yǎng) ? 神經原細胞培養(yǎng)需要極高的營養(yǎng)條件，培養(yǎng)器皿也需要經過特殊處理，神經軸突在膠原和聚 L— 賴氨酸（ PolyLlysine）溶液中可以旺盛生長，神經生長因子（ NGF）可促進神經原的生長。 ? 肌肉組織培養(yǎng)：指將肌肉組織植塊或分散的肌肉細胞在離體條件下生存、生長或發(fā)育的技術。 肌肉組織的體外培養(yǎng) ? （ 1）肌肉組織的特點 ? 肌肉組織（肌組織）細胞間結締組織少、血管和神經豐富。在 75cm2培養(yǎng)瓶中接種5 106~105個即可，培養(yǎng) 3~4d可獲得 3~5 106個細胞，可再行胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)初期可觀察到上皮細胞的纖維樣細胞混雜生長經數次傳代后纖維樣細胞逐漸消失。 ? 結果及鑒定 培養(yǎng)的細胞必須鑒定，以排除間充質細胞混雜。 ? 國內已建立的腫瘤細胞系主要有：來自白血病患者的淋巴樣的 J6懸浮生長型的胃癌 SL79上皮型的肝癌 SMMC772鼻咽癌 CNE成骨肉癌 OC861結腸癌 THC8910,以及多形型的胸膜間皮癌 SMC1等等。 ? 培養(yǎng)成分上，由采用純血清培養(yǎng)到含血清培養(yǎng)基、再到無血清培養(yǎng)基三個階段。 發(fā)展成就 ? 在培養(yǎng)的腫瘤細胞類型上，經歷了從間充質源性的細胞轉上皮源性細胞、再由神經外胚層源性到造血源性的發(fā)展歷程。 ? 后來，口腔癌、喉癌、肺癌等細胞系相繼建立。 ? 腫瘤細胞的體外培養(yǎng)與建系過程 ? 上皮細胞培養(yǎng) ? 表皮組織培養(yǎng) ? 肌肉組織培養(yǎng) ? 神經元細胞培養(yǎng) 第四節(jié) 動物細胞體外培養(yǎng)舉例 腫瘤細胞的體外培養(yǎng)的歷史 ? 1906年， Beebe和 Ewing最早成功培養(yǎng)狗的淋巴肉瘤細胞； ? 1911年， Carrel最先在體外培養(yǎng)了纖維軟骨瘤及黑色素瘤細胞。在倒置相差顯微鏡下觀察，著色的細胞為死亡細胞，視野下有較多細胞死亡為陽性。 人主要組織相容性抗原 ? 人主要組織相容性抗原（ HLA抗原）存在大多數有核細胞膜上，常用抗原檢測是用補體依賴細胞毒試驗，用拒染來鑒定細胞活性。 ? 染色體核型分析足以鑒定不同種間細胞系之間的污染。根據同種異體同工酶的表型和正常人群體的表型頻率資料，可以估計出一特定細胞系遺傳特征出現的頻率。該法有高度的可靠性，簡單、重復性好。后加上的熒光抗體將結合到已標記有兔抗體的靶細胞上，借助熒光即可看到抗原－抗體復合物。 （ 4）細胞活力的計算 活細胞率 = 活細胞總數 / （活細胞總數 +死細胞總數） ? 100% （三）培養(yǎng)細胞種屬鑒定方法 熒光抗體染色鑒別細胞的種屬 ? 間接熒光抗體染色技術 — 采用兔產生的特異性抗血清標記待測細胞和陽性細胞、陰性細胞。 ? 缺點：操作繁瑣 ? 優(yōu)點：精確、可靠 臺盼藍法 ? 活細胞不被染色 ， 死細胞染成藍色 ， 用活細胞占 ? 細胞中的百分比表示細胞活力 ? 臺盼藍排斥試驗： （ 1）臺盼藍濃度： 母液： 4%，用雙蒸水配制；工作液：%，用 PBS稀釋。 這種方法常用于抗癌藥物敏感性試驗 、腫瘤放射生物學試驗等 ?？寺⌒纬陕视脕肀硎炯毎脑鲋衬芰? ? 克隆形成率＝克隆形成數／接種細胞數 ， 通過計數克隆形成率 ， 可對單個細胞的增殖潛力作定量分析 ， 了解細胞的增殖率和對生存環(huán)境的適應性 。 ? 任何培養(yǎng)瓶內生長的細胞都由死細胞和活細胞組成 ， 從形態(tài)上區(qū)別死 、 活細胞是困難的 。 3） 計算 : 分裂指數 =分裂細胞數 /總細胞數 100% 細胞周期 （ 1）放射性核素標記自顯影 用 3H標記脫氧胸腺嘧啶核苷 處理 30min后，每間隔 30min取材，直到 48h為止，觀察和計算細胞分裂相出現時間、高峰和消失分裂相數，繪圖分析。 ? 取出蓋片，按下列順序操作： 1） PBS漂洗 3分鐘 → 甲醇：冰醋酸 =3： 1固定液中固定 30分鐘 → Giemsa液染色 10分鐘 → 自來水沖洗。 步驟 ? 消化細胞，將細胞懸液接至內含蓋玻片的培養(yǎng)皿中。它與生長曲線有一定的聯系，如隨著分裂指數的不斷提高，細胞也就進入了指數生長期。 ? 用于測細胞增殖、細胞存活和細胞毒性。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。 （ 3）吸出孔內培養(yǎng)液后，加入DMSO液（ 150微升／孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩 10分鐘，使結晶物溶解。再用酶標儀測定 OD值 ? MTT法簡單快速、準確，廣泛應用于新藥篩選、細胞毒牲試 ? 驗、腫瘤放射敏感性實驗等。 2）、 四唑鹽（ MTT）比色法 ? 四唑鹽 （ MTT） 商品名為噻唑藍 ， ? 四 唑 鹽比色法的原理：活細胞中脫氫酶能將四 唑 鹽還原成不溶干水的藍紫色產物（ formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。連續(xù)計數 7 d。 ? 24 h后開始計數細胞，以后每隔 24 h計數一次，每次取 3瓶細胞，分別進行計數。如是非貼壁細胞，則離心棄舊培養(yǎng)基后，換上一定量的新鮮培養(yǎng)基然后制成細胞懸液計數。 ? 鏡下觀察計數： 計算計數板四角大格內的細胞數，壓線者只計算 左側和上方的 ,右側和下方的不計算在內。 ? 從蓋片邊緣滴加細胞懸液，使其充滿計數板和蓋片間的空隙中。 定期消毒培養(yǎng)箱。 ? 細胞交叉污染及檢測 ? 不容易發(fā)生，常見的細胞形態(tài)觀察可以區(qū)分。 4）病毒的污染及檢測 ? 濾器對病毒沒有任何阻擋作用，通常不容易被污染，因為病毒不能在細胞外復制，而且它們通常具有宿主細胞的感染限制。支原體代謝需固醇類物質，部分種類需要精氨酸、 ?2或葡萄糖，每一種支原體都有自身特點。支原體多吸附或散在于細胞表面和細胞之間。 ? 電鏡檢查：用掃描電鏡方法簡便快速，也可以利用透射電鏡。染色后用蒸餾水洗 12min，向細胞面滴加 酸緩沖液數滴，然后置熒光顯微鏡下觀察。 ? 相差顯微鏡檢測：將細胞接種于事先放置于培養(yǎng)瓶內的蓋玻片上， 24h后取出，用相差油鏡觀察，支原體呈暗色微小顆粒位于細胞表面和細胞之間； ? 熒光染色法：用能與 DNA特異性結合的熒光染料Hoechst33258，可使支原體內含有的 DNA著色，染色后用熒光顯微鏡觀察。 3）支原體的污染和防止 支原體是一種介于細菌和病毒之間、能獨立生活的微生物，無細胞壁，直徑最小可以達到 μm，在 的濾膜過濾仍然有 1%左右的支原體可以通過。在顯微鏡下可見絲狀細胞的交叉。 防止，通常在嚴格的實驗操作之外，培養(yǎng)基中加入青霉素、鏈霉素能夠有效的防止細菌污染。 1）細菌的污染及檢測 多數培養(yǎng)細胞在遭到細菌的污染后，培養(yǎng)液短期內顏色變黃，產生大量酸性物質，出現明顯混濁現象，可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮。 微生物污染 在長時間多量培養(yǎng)工作中，即使用品消毒操作嚴密，亦難避免偶爾發(fā)生污染。用磷酸鹽緩沖系統(tǒng)時，可因瓶口漏氣， CO2溢出，也可能由于培養(yǎng)瓶和瓶塞洗刷不潔殘留堿性物，使之變堿發(fā)紅。用一般溫箱培養(yǎng)時，隨細胞生長時間的延長， CO2積累增多，在超越緩沖范圍后，營養(yǎng)液酸化變黃，如不及時調節(jié) PH，對細胞會發(fā)生不利影響，嚴重時細胞脫落死亡。只有當細胞分裂出現后，細胞數量逐漸增多，形成較大的生長暈或連接成片時，才真正進入了生長狀態(tài)。在游走細胞之后，接著出現的是成纖維細胞或上皮細胞。因此生長與否尚不能作為判定細胞好壞的唯一標準，必須做全面分析。只有狀態(tài)良好的細胞才宜利用進行實驗。 細胞形態(tài) 生長狀態(tài)良好的細胞，在一般顯微鏡下觀察時透明度大，輪廓不清，只有用相差顯微鏡，才能看清細胞的細微結構。 優(yōu)點：培養(yǎng)狀態(tài)恒定，細胞在穩(wěn)定的狀態(tài)下生長。 缺點：開放式操作，容易造成污染。而且收液率低 . 優(yōu)點：生產效率高，可反復長期培養(yǎng)，反復收獲產品。 生物反應器應用概況 * 動物細胞培養(yǎng)常用的生物反應器： ? 柱狀中空纖維反應器 ? 板框式中空纖維反應器 ? 中心灌流式反應器 ? 灌流微載體生物反應器 ? 旋轉壁式反應器 （三）動物細胞大