【正文】 * 人造角膜 第一百八十七頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。用膠質(zhì)原纖維酸性蛋白作為標(biāo)記物可判斷混雜在其中的膠質(zhì)細(xì)胞。 3 分裝：每瓶 1ml，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。間期〔 G1+S+G2〕。 第一百八十六頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 第一百八十五頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 〔 10〕搖擺式器官培養(yǎng)法 1976年，巴雷特〔 Barret〕創(chuàng)立 第一百八十三頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 〔 7〕瓊脂小島器官培養(yǎng)法 〔 8〕陳氏濾紙虹吸器官培養(yǎng)法 1964年，陳瑞銘創(chuàng)造。 〔 3〕懸浮培養(yǎng)法 〔 4〕直接漂浮培養(yǎng)法 1948年，梅達(dá)沃〔 Medawar〕設(shè)計(jì) 〔 5〕擦鏡紙培養(yǎng)法 第一百八十二頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法 〔 1〕表玻璃器官培養(yǎng)法 1929年，費(fèi)爾〔 Fell〕和魯濱遜 〔 Robinson〕建立 〔 2〕瓊脂凝膠培養(yǎng)法 沃爾夫〔 Wolff〕和施奈德〔 Schneider〕 第一百八十頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 2 器官培養(yǎng)技術(shù) 器官培養(yǎng)可分為：胚胎器官培養(yǎng)和成年器官培養(yǎng) 培養(yǎng)原那么：① 提供充足的氧氣和養(yǎng)料，及時(shí)排除廢物。 器官培養(yǎng)特征 〔 1〕被培養(yǎng)的器官在體外存活較長(zhǎng)時(shí)間，并保存相對(duì)正常的功能，器官內(nèi)的細(xì)胞有正常的代謝甚至增殖。 第一百七十六頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 1 定義與特點(diǎn) 器官培養(yǎng)：取出動(dòng)物器官或進(jìn)一步修整成器官型植塊，將其培養(yǎng)使其存活和生長(zhǎng)的過(guò)程。 篩選同步化細(xì)胞 誘導(dǎo)同步化細(xì)胞 M期細(xì)胞震蕩脫落法 離心洗脫法 梯度沉降法 血清饑餓法 異亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺乏法 DNA合成抑制劑阻斷法 秋水仙素阻斷法 第一百七十四頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 第一百七十三頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 第一百七十二頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 〔 4〕目前對(duì)細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的研究比較欠缺。 〔 2〕細(xì)胞群體在大規(guī)模 ,長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過(guò)程中分泌產(chǎn)物能力易喪失 ,或產(chǎn)物活性易降低。 ? 細(xì)胞培養(yǎng)目的與用途 ? 1. 藥物研究與開(kāi)發(fā) ? (1) 新藥篩選 :如化學(xué)合成藥物藥效研究 ,中藥有效成分篩選與鑒定等 . ? (2) 疫苗研究與開(kāi)發(fā) :如病毒性疫苗的研究與開(kāi)發(fā) (肝炎病毒疫苗 ,艾滋病疫苗等 ),腫瘤疫苗(多肽疫苗 )等 . ? (3) 基因工程藥物研究與開(kāi)發(fā) :如干擾素研究與開(kāi)發(fā) ,細(xì)胞生長(zhǎng)因子研究與開(kāi)發(fā)等 . ? (4) 細(xì)胞工程藥物研究與開(kāi)發(fā) :生物活性多肽研究與開(kāi)發(fā) ,人參皂甙 ,紫杉醇等生物活性成分研究與開(kāi)發(fā) . ? (5) 單克隆抗體制備 :包括診斷用單克隆抗體 ,治療用單克隆抗體 . ? 根底研究 ? (1) 藥物作用機(jī)理 ? (2) 基因功能 ? (3) 疾病發(fā)生機(jī)理 ? 2, 生物制藥 ? (1) 疫苗生產(chǎn) :如病毒性疫苗 (肝炎病毒疫苗 ,艾滋病疫苗等 ),腫瘤疫苗 (多肽疫苗 )等 . ? (2) 基因工程藥物生產(chǎn) :如在臨床醫(yī)學(xué)中具有治療價(jià)值的一些細(xì)胞生長(zhǎng)因子如干擾素 ,粒細(xì)胞生長(zhǎng)因子 ,胸腺肽等 (3) 診斷用和藥用單克隆抗體生產(chǎn) ? (4) 細(xì)胞工程藥物生產(chǎn) :生物細(xì)胞內(nèi)的一些生物活性多肽 ,生物活性物質(zhì)等 第一百七十一頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 【用品】 DMEM培養(yǎng)液：其中加有 10%熱滅胎牛血清， 30m mol/L葡萄糖， — 谷氨酰胺， mol/L KCL， 100mU/L胰島素， 7μmol/L P— 氨基苯酸， 100μg/ml慶大霉素 Hands 平衡鹽液，其中參加牛血清白蛋白 3g/L (HBSS) 聚 L— 賴氨酸，分子量大于 300,00 胞嘧啶阿拉伯糖 Ⅱ 型胰蛋白酶〔 %，溶于 HBSS〕 硅膠〔 Aquasil, Pierce 42799〕 ， Pasteur滴管， 10ml移液器〔無(wú)菌〕 12ml和 50ml無(wú)菌試管、無(wú)菌手術(shù)器械、水浴箱 【鑒定方法】 用神經(jīng)原特異性烯醇抗體或破傷風(fēng)毒素作為標(biāo)記物，經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測(cè)可判定神經(jīng)原細(xì)胞；用膠質(zhì)原纖維酸性蛋白作為標(biāo)記物可判斷混雜在其中的膠質(zhì)細(xì)胞。 從出生 4~8d的大鼠腦組織取材培養(yǎng)，培養(yǎng)液中參加胞嘧啶阿拉伯糖抑制非神經(jīng)原細(xì)胞，可獲得特征明顯的腦神經(jīng)細(xì)胞。經(jīng)歷了組織塊培養(yǎng) →別離細(xì)胞培養(yǎng) →單一型細(xì)胞階段 第一百六十九頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 〔 2〕骨骼肌的培養(yǎng) 第一百六十八頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。肌細(xì)胞長(zhǎng)梭形，又稱肌纖維。 第一百六十七頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。在 75cm2培養(yǎng)瓶中接種 5 106~105個(gè)即可，培養(yǎng) 3~4d可獲得 3~5 106個(gè)細(xì)胞，可再行胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)初期可觀察到上皮細(xì)胞的纖維樣細(xì)胞混雜生長(zhǎng)經(jīng)數(shù)次傳代后纖維樣細(xì)胞逐漸消失。 ? 結(jié)果及鑒定 ? 培養(yǎng)的細(xì)胞必須鑒定，以排除間充質(zhì)細(xì)胞混雜。 表皮組織的體外培養(yǎng) * 表皮細(xì)胞分兩類： 角質(zhì)形成細(xì)胞、非角質(zhì)形成細(xì)胞 * 角質(zhì)形成細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)： 1975年，萊因沃德〔 Rheinwald〕和格林〔 Green〕創(chuàng)立飼養(yǎng)層培養(yǎng)法 第一百六十六頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 第一百六十四頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 ? 在對(duì)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性研究水平上，經(jīng)歷了從細(xì)胞水平到亞細(xì)胞水平，再到酶和分子水平的開(kāi)展時(shí)期。 ? 在培養(yǎng)方法上，經(jīng)歷了從原代培養(yǎng)到傳代培養(yǎng)、再到細(xì)胞系的建立的開(kāi)展過(guò)程。 第一百六十三頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 ? 后來(lái)，口腔癌、喉癌、肺癌等細(xì)胞系相繼建立。 腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)的歷史 ? 1906年， Beebe和 Ewing最早成功培養(yǎng)狗的淋巴肉瘤細(xì)胞； ? 1911年， Carrel最先在體外培養(yǎng)了纖維軟骨瘤及黑色素瘤細(xì)胞。 第一百六十一頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 第一百六十頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 原理： HLA抗體與淋巴細(xì)胞外表的相應(yīng)抗原結(jié)合后激活補(bǔ)體，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，通透性增強(qiáng)，染料進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞死亡。 第一百五十九頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 染色體核型分析足以鑒定不同種間細(xì)胞系之間的污染。 第一百五十八頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。利用同工酶分析檢驗(yàn)細(xì)胞的交叉污染 G6PD、 LDH、 NP的電泳遷移率差異不僅可用來(lái)鑒別細(xì)胞系所屬種屬，還可查出種內(nèi)細(xì)胞的交叉污染。 同工酶譜系鑒別細(xì)胞種屬 通過(guò)確定三種同工酶系統(tǒng)〔 6磷酸葡萄糖脫氫酶〔 G6PD〕，乳酸脫氫酶〔 LDH〕和核苷磷酸化酶〔 NP〕的垂直淀粉膠電泳的遷移率，可以鑒定細(xì)胞系的種屬來(lái)源。后加上的熒光抗體將結(jié)合到已標(biāo)記有兔抗體的靶細(xì)胞上，借助熒光即可看到抗原－抗體復(fù)合物。 〔三〕培養(yǎng)細(xì)胞種屬鑒定方法 熒光抗體染色鑒別細(xì)胞的種屬 間接熒光抗體染色技術(shù) — 采用兔產(chǎn)生的特異性抗血清標(biāo)記待測(cè)細(xì)胞和陽(yáng)性細(xì)胞、陰性細(xì)胞。 ? 〔 4〕 細(xì)胞活力的計(jì)算 ? 活細(xì)胞率 = 活細(xì)胞總數(shù) / 〔 活細(xì)胞總數(shù) +死細(xì)胞總數(shù) 〕 100% 第一百五十五頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 臺(tái)盼藍(lán)法 ? 活細(xì)胞不被染色 ， 死細(xì)胞染成藍(lán)色 ， 用活細(xì)胞占 ? 細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力 ? 臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)： ? 〔 1〕 臺(tái)盼藍(lán)濃度： 母液： 4%， 用雙蒸水配制；工作液： %， 用PBS稀釋 。常用的方法有平板克隆形成試驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)。克隆形成率高者其獨(dú)立生存能力強(qiáng)。 ? 1 、細(xì)胞克隆形成率實(shí)驗(yàn) 克隆形成試驗(yàn)是測(cè)定單個(gè)細(xì)胞增殖能力的有效方法之一，其根本原理是單個(gè)細(xì)胞在體外增殖 6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體形成肉眼可見(jiàn)的克隆。 培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定 ? 細(xì)胞活力測(cè)定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一。 細(xì)胞周期 〔 1〕放射性核素標(biāo)記自顯影 用 3H標(biāo)記脫氧胸腺嘧啶核苷 處理 30min后，每間隔 30min取材，直到 48h為止，觀察和計(jì)算細(xì)胞分裂相出現(xiàn)時(shí)間、頂峰和消失分裂相數(shù)，繪圖分析。 2〕蓋片晾干后反扣在載玻片上，鏡檢。 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48小時(shí)，使細(xì)胞長(zhǎng)在蓋片上。 第一百五十一頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。它與生長(zhǎng)曲線有一定的聯(lián)系，如隨著分裂指數(shù)的不斷提高，細(xì)胞也就進(jìn)入了指數(shù)生長(zhǎng)期。 第一百五十頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈良好線性關(guān)系。 CCK8試劑盒 ? 原理： ? Cell Counting Kit8〔 CCK8試劑盒〕是檢一種基于水溶性四唑鹽的廣泛應(yīng)用快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒，為 MTT法的替代方法，試劑盒中采用水溶性四唑鹽在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶復(fù)原生成橙黃色的 formazan。 ? 〔 3〕吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，參加DMSO液〔 150微升／孔〕，將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩 10分鐘，使結(jié)晶物溶解。 第一百四十八頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。二甲亞砜〔 DMSO〕能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的 formazan量成正比。 第一百四十七頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。連續(xù)計(jì)數(shù) 7 d。 ? 24 h后開(kāi)始計(jì)數(shù)細(xì)胞，以后每隔 24 h計(jì)數(shù)一次，每次取 3瓶細(xì)胞，分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。如是非貼壁細(xì)胞，那么離心棄舊培養(yǎng)基后，換上一定量的新鮮培養(yǎng)基然后制成細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)。 第一百四十六頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 ? 注意：勿使液體漫過(guò)蓋片或出現(xiàn)氣泡。 ? 用酒精沖洗計(jì)數(shù)板后擦凈，將蓋片覆在計(jì)算板上，微微移向一側(cè)， 以便滴加細(xì)胞懸液 . ? 取一吸管伸入培養(yǎng)瓶，輕輕吹打細(xì)胞懸液，混勻。 細(xì)胞生長(zhǎng)情況 ?細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定 ?1〕、細(xì)胞計(jì)數(shù)法 ?血細(xì)胞計(jì)數(shù)器：人工計(jì)數(shù)細(xì)胞 ?Counter計(jì)數(shù)儀 第一百四十四頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 第一百四十二頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 第一百四十頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 定期消毒培養(yǎng)箱。 第一百三十八頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。通常其檢測(cè)方式是抗體檢測(cè)及 PCR檢測(cè)。 第一百三十七頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 ? DNA分子雜交檢查或支原體培養(yǎng)等方法：檢出率高，但方法較復(fù)雜。橫斷面與細(xì)胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無(wú)顆粒群或中央束。 ? 鏡下觀察支原體膜為三層結(jié)構(gòu)，其中央有電子密度大的密度顆粒群或絲狀的中心束。 第一百三十五頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。染色后用蒸餾水洗 12min，向細(xì)胞面滴加 ，然后置熒光顯微鏡下觀察。 ? 相差顯微鏡檢測(cè)：將細(xì)胞接種于事先放置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的蓋玻片上，24h后取出，用相差油鏡觀察，支原體呈暗色微小顆粒位于細(xì)胞外表和細(xì)胞之間； ? 熒光染色法：用能與 DNA特異性結(jié)合的熒光染料 Hoechst33258，可使支原體內(nèi)含有的 DNA著色，染色后用熒光顯微鏡觀察。支原體污染后的培養(yǎng)細(xì)胞中沒(méi)有明顯可見(jiàn)的特征，所以很難發(fā)現(xiàn)。 第一百三十三頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 防止，酒精棉球擦洗去除瓶口污染，必要時(shí)參加抗真菌劑。 2〕真菌的污染檢測(cè) 真菌的污染物通常是培養(yǎng)基外表漂浮的白色及黃色、黑色的小點(diǎn)。 防止，通常在嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)操作之外，培養(yǎng)基中參加青霉素、鏈霉素能夠有效的防止細(xì)菌污染。 1〕細(xì)菌的污染及檢測(cè) 多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞在遭到細(xì)菌的污染后，培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象，可見(jiàn)培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮。 污染的途徑 ? 污染途徑 空氣、器材、操作、血清、組織樣品 ?污染對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響及檢測(cè) 體外培養(yǎng)細(xì)胞自身沒(méi)有抵抗污染的能力，而且培養(yǎng)基中參加的抗生素的抗污染能力也是有限的，因而培養(yǎng)細(xì)胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無(wú)法挽救。 微生物污染 在長(zhǎng)時(shí)間多量培養(yǎng)工作中，即使用品消毒操作嚴(yán)密，亦難防止偶爾發(fā)生污染。更換營(yíng)養(yǎng)液時(shí)間，可依營(yíng)養(yǎng)物的消耗而定，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛時(shí)２－３天換一次，生長(zhǎng)緩慢時(shí)，３－４天亦可。培養(yǎng)液中加 Hepes或用５％ CO2溫箱培養(yǎng)可使 PH維持穩(wěn)定。 培養(yǎng)液 在正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色。只有當(dāng)細(xì)胞分裂出現(xiàn)后，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，形成較大的生長(zhǎng)暈或連接成片時(shí)，才真正進(jìn)入了生長(zhǎng)狀態(tài)。在游走細(xì)胞之后，接著出現(xiàn)的是成纖維細(xì)胞或上皮細(xì)胞。 第一百二十六頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。在很多情況下，細(xì)胞雖機(jī)能狀態(tài)不良，但仍可生長(zhǎng)，如支原體輕度污染時(shí)即如此。細(xì)胞機(jī)能不良時(shí)，輪廓增強(qiáng)，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物，細(xì)胞之間空隙加大，細(xì)胞形態(tài)可變得不規(guī)那么甚至失去原有特點(diǎn)，如上皮細(xì)胞變成類纖維細(xì)胞等。 第一百二十五頁(yè)，共一百八十七頁(yè)。 關(guān)鍵技術(shù) ? 細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境 ：氨離子、乳酸、二氧化碳、甲基乙二醛、滲透壓、載體 … ? 細(xì)胞死亡與凋亡 ：基因工程的調(diào)控 … ? 培養(yǎng)基與細(xì)胞系：無(wú)血清培養(yǎng)基的研發(fā)，基因工程的