細胞總rna提取及逆轉錄(編輯修改稿)
2025-05-28 08:08 本頁面
【文章內容簡介】 ol 試劑中 ， 蓋緊蓋 ， 上下顛倒混合 2min以上 。 使組織細胞 充分裂解 。 肉眼觀察可見液體變成均勻渾濁狀 。 4)室溫孵育 10 min。 三、 RNA提取的實驗操作 異硫氰酸胍法 ： GuSCN 是一種強的蛋白質變性劑，裂解細胞的同時，還能有效地抑制內源性 RNase的活性，通過有機溶劑的分步抽提，可獲得純度較高的細胞總 RNA。 特點：需低溫操作，但價格經濟。 Trizol 試劑 （商品化產品） 特點：在室溫下可以提取細胞總 RNA， 簡單、快速、提取量大、純度高。 mRNA提取試劑盒 真核細胞 mRNA的 3末端有 ploy(A)尾，利用寡聚 dT纖維素結合 mRNA，將其從細胞總 RNA中分離出來。 課間介紹 RNA提取的幾種方法 RNase抑制劑介紹 DEPC ( 二乙基焦炭酸鹽 ) 最常用的 RNase抑制劑 : 與蛋白質中的組氨酸結合，使蛋白質變性。 有效濃度： %%(DEPC水 )，室溫磁力攪拌 20分鐘。用于浸泡各種器材。 滅活條件：高壓。 在 Tris溶液中半衰期為 。 試劑的配制 :無 RNase的溶液 (用 DEPC水配制 , 高壓 ) 儲存方法：不能用聚苯乙烯器皿。 4 ?C ，或液氮中。 肝素 ： 使用濃度： — 10mg/ml 效 果 : 37 ?C 時，可抑制 95%的 RNase活力。 如果與 DEPC聯合應用，具有極強的抑制效果。 5)加入 200 ?l氯仿 ， 震蕩混勻 2030s， 室溫放置 5min（此期間液體開始 分層 ，此時不要輕易攪動液體 ）。 ６ )10000 rpm，離心 5min。 RNA (清澈透明 ) DNA Protein 7) 將清澈透明的 上 層水相 轉移至另一離心管中。 三、 RNA提取的實驗操作 8) 沉淀 RNA： 加入 ，上下顛倒混勻，室溫放置 10min。 10000rpm， 離心 10min。 棄上清 。 ９ ) 加 1ml 75%乙醇 洗滌管壁。 (注意貼管壁在沉淀的對側緩慢加入，不要攪動沉淀 ) 10) 7500rpm離心 1min， 棄上清 。 再離心幾秒鐘 ， 將管壁液體 （ 用加樣器 ） 完全移凈 。 用 TriZol試劑提取總 RNA時，全程均在 室溫 進行。 當 RNA沉淀用水溶解后，應該注意在 冰上 操作，操作要迅速。 12)室溫干燥 3－ 5min。 （ 干燥的時間由 RNA沉淀大小決定 ） （ 干燥后的沉淀應該是 無色膠樣透明狀 ， 沉淀要充分干燥但避免過分干燥 ， 此步驟非常關鍵 ） 注意事項 ： RNA: 避免放在 37 ?C孵箱中過度干燥以防
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