細(xì)胞總rna提取及逆轉(zhuǎn)錄-資料下載頁
2025-05-01 08:08本頁面
【正文】 RNA樣品 ? l 上樣緩沖液 3 ? l 混勻后， ? l 直接電泳上樣（ 100伏， 10－ 30分鐘） 上樣前可先預(yù)電泳 5min。 注意 : 電泳槽的清潔！ 所有試劑、器材、溶液需要滅 RNA酶處理。 瓊脂糖凝膠要新鮮配制！ 紫外透射儀觀察電泳結(jié)果 ?第三步： RNA 的甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳 第二步： 向上述反應(yīng)溶液中依次加入下列試劑： 5?RTbuffer 4 ?l RNasin (40U/ml) 1 ?l dNTPs (10mmol/L) 4 ?l AMV 1 ?l 輕彈管底混合 ， 置 42℃ 水浴 1h。 將上述反應(yīng)移至 68℃ 水浴 10min（ 滅活 RTase） ， 并冰浴 ， 保存?zhèn)溆?。 混勻后，可用離心機(jī)甩一下 基本過程同 DNA電泳一樣，但： 1. 必須用對(duì) RNA酶有抑制作用 DEPC水來配置所有溶液，所有與 RNA接觸的儀器和裝置都要嚴(yán)格處理以 盡量減少 RNA酶對(duì)樣品的降解 ； 2. 因?yàn)?RNA分子有二、三級(jí)結(jié)構(gòu)可以影響其電泳結(jié)果，因此電泳時(shí)應(yīng)在變性劑存在下進(jìn)行變性電泳以 打開其空間結(jié)構(gòu) ，常用的變性劑為甲醛和戊二醛。 RNA電泳 RNA電泳結(jié)果 rRNA可以作為內(nèi)部Marker分子，通過觀察 rRNA的兩條帶 （ 28S和 18S）的比例 ，可以判斷所提取 mRNA是否存在降解。 RNA電泳并不能判斷 mRNA是否提取成功，也不作為鑒定 RNA提取質(zhì)量的常規(guī)方法，因?yàn)?在電泳過程中 RNA可能發(fā)生降解 。 分析本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 28S、 18S和 5S的比例。 RNA電泳結(jié)果分析 RT引物的用量非常少，因?yàn)槟０辶渴枪潭ǖ?，而且只進(jìn)行一次反應(yīng)。 關(guān)鍵點(diǎn)： ?RNA是否充分溶解 ?根據(jù)組織或細(xì)胞的量確定逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的體積，通常利用 1ml Trizol試劑提取出來的總 RNA適合于 20?l體積的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。 ?引物的量是否合適 ?高溫退火避免 Oligo dT錨錠點(diǎn)錯(cuò)誤，同時(shí)，打開 RNA鏈之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)，利于 RT。 ?退火后一定迅速放在冰上 實(shí)驗(yàn)報(bào)告思考題： RNA時(shí)，如何防止 RNA酶的污染？ RNA變性電泳的結(jié)果，可以據(jù)此準(zhǔn)確判斷 RNA是否降解嗎？為什么？ 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后： ? 整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)； ? 交實(shí)驗(yàn)報(bào)告； ? 值日生值日。
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