【文章內(nèi)容簡介】 鹽溶液，溶解的最佳 pH是 89，充分溶解后過濾除菌，可再調(diào)整 pH至 。 EDTA溶液 一般濃度為 %，配制時加堿助溶，可過濾除菌，也可高壓滅菌。 膠原酶溶液 一般為 mg/L或 20萬 U/L，最佳 pH為 ，膠原酶不受Ca2+、 Mg2+及血清的抑制，配制時可用 PBS。 消化液 常用濃度為 % （ %%） 稱取所需胰蛋白酶，用少許 DHanks液調(diào)成糊狀 再補足 DHanks液，攪拌混勻，置室溫 4 h或冰箱過夜，不斷攪拌振蕩 次日，濾過除菌，分裝， 20 ℃ 凍存 胰蛋白酶液配制 消化液 EDTA2Na 溶液 一種化學螯合劑，對細胞有一定的離散作用，而且毒性小，價格低廉，使用方便 常用工作液濃度為 %。 注意：使用 EDTA 處理細胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的 EDTA會影響細胞生長 EDTA 溶液配制：用 DHanks 液溶解后，高壓蒸汽滅菌，小瓶分裝， 4 ℃ 保存 pH調(diào)整液 為了營養(yǎng)成分穩(wěn)定和延長貯存時間，在配制營養(yǎng)液時一般不預先加入 NaHCO3，而在使用前再加入。故 NaHCO3都是單獨配制，高壓滅菌。 此外，為了維持培養(yǎng)液恒定的 pH，以利于細胞的生長和增殖，還可利用 Hepes強緩沖液。 pH調(diào)整液 NaHCO3 溶液 常用濃度為 %。配制時用三蒸水溶解后，濾過除菌或高壓滅菌，分裝， 4 ℃ 保存 調(diào)節(jié) pH時， NaHCO3要逐滴加入，并不時搖動培養(yǎng)液，以防止加入過量。當 pH值過高后，可用滅菌的 10％醋酸溶液或通入 CO2氣體調(diào)節(jié)。 pH調(diào)整液 Hepes液 一種弱酸，中文名為 4羥乙基哌嗪乙硫磺酸，分子式為：C8H18O4N2S，分子量為 。 主要作用 : 防止培養(yǎng)基 pH迅速變動。 使用終濃度一般為 1050 mmol/L 常配成 1 M 儲存液：用 100 ml 雙蒸水溶解 g Hepes，濾過除菌或高壓滅菌，分裝小瓶， 4 ℃ 保存。使用時可向 100 ml培養(yǎng)液中加入 1 ml Hepes儲存液，終濃度為 10 mmol/L 青鏈霉素溶液 俗稱雙抗溶液，青霉素對 G+菌有效，使用終濃度為10萬 U/L，鏈霉素對 G菌有效， 使用終濃度為。 一般配成 100倍濃縮液，可用 PBS或培養(yǎng)基配制。 抗生素液 各種抗生素使用情況 抗生素 作用對象 參考濃度 (ug/ml) 穩(wěn)定性 (d) 兩性霉素 B 真菌 1 3 氨芐青霉素 G+， G 100 3 氯霉素 G 5 5 紅霉素 G+，支原體 100 3 慶大霉素 G+， G，支原體 50 5 卡那霉素 G+， G 100 5 制霉菌素 真菌 50 3 青霉素 G G+ 100IU/ml 3 鏈霉素 G 100 3 福利平 G 50 3 四環(huán)素 G+， G，支原體 10 4 使用終濃度為 2 mM。 一般配成 100倍濃縮液，配制時加溫至 30 oC，充分溶解后過濾除菌，分裝后 20 oC儲存。 谷氨酰胺補充液 （二）細胞培養(yǎng)的設備條件 一定的密閉性 通風透氣良好 ， 但不會因此造成室內(nèi)污染 適合于消毒 方便進出但不會因此而影響無菌室的 “ 無菌性 ” ， 保證工作空間的 “ 絕對 ” 無菌 一般包括：準備室 、 培養(yǎng)室和緩沖室 無菌室的條件 準備室： 用于進行培養(yǎng)器皿的清洗、包裝、培養(yǎng)物質(zhì)的準備和消毒以及供應物品的保藏等。 培養(yǎng)室： 用于進行細胞培養(yǎng)和各種無菌操作的實驗室。其基本條件是： 清潔、無菌、干燥、不通風，并具有適宜的光線。 緩沖室：（更衣室） 緩沖室 單間培養(yǎng)實驗室布局示意圖 專用培養(yǎng)實驗室布局示意圖 普通細胞培養(yǎng)室內(nèi)走廊 寬敞的細胞培養(yǎng)區(qū) 超凈工作臺 ， CO2培養(yǎng)箱 ， 倒置顯微鏡 干燥箱 ， 濾器 ， 自動雙重純水蒸餾器 ， 純水儀 ， 壓力蒸汽消毒器 離心機及天平 冰箱 ， 細胞冷凍存儲器 (液氮容器或低溫冰箱 ) 常用培養(yǎng)器皿：培養(yǎng)瓶 ， 培養(yǎng)皿 ， 多孔培養(yǎng)板 ， 吸管 ，加樣器 其它用品：離心管 ， 凍存管 ， 酸缸 ， 細胞計數(shù)板 /儀 ，燒杯 ， 注射器 ， 量筒等 無菌室內(nèi)的設備 培養(yǎng)設備 常用培養(yǎng)器皿 玻璃培養(yǎng)器皿為主，一次性培養(yǎng)器皿為輔。 玻璃器皿 玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管和吸管、離心管、其它 塑料器皿 培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、多孔培養(yǎng)板、移液管、離心管、注射器、其它 超凈工作臺(clean bench) 利用鼓風機驅動空氣通過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣以微流方式徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構成無菌環(huán)境。 注意檢查是否堵塞?。淳凭珶簦? 外流式 （基本不用） 側流式 直流式 超凈工作臺結構和模式圖 生物安全柜 CO2培養(yǎng)箱 ? CO2培養(yǎng)箱設定的條件為 37 ℃ ，5％ CO2， 85%濕度。 ? 使用 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應注意的問題： ? 用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。 ? 保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈，定期消毒（紫外線、酒精）。 ? 箱內(nèi)水槽中加滅菌蒸餾水 3 L以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。 學生正在進行細胞觀察 倒置顯微鏡 倒置顯微鏡 用于烘干和干熱消毒玻璃器皿（ 160 ℃ ， 2 h）。 電熱干燥箱 濾 器 Zeiss濾器：過濾除菌，大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌 自動雙重純水蒸餾器 純水儀 紫外燈 紫外線消毒。 主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒 大容量高壓蒸汽滅菌器 全自動手提式滅菌器 移液器 含有兩個室，每個室被劃分為 9個方陣，其中 4個方陣有 16個小方格，為 mm3 或 1 104 ml，細胞濃度取決于已知體積中的細胞數(shù)。 細胞計數(shù)板 精密 pH計 微孔板震蕩器 磁力攪拌器 高速離心機 超速離心機 液氮罐 四、細胞培養(yǎng)物的污染及防止 凡混入培養(yǎng)環(huán)境中對細胞生存 有害 的成分和造成細胞 不純 的異物，都應視為污染。 污染對細胞的影響 根據(jù)污染物和污染程度的不同，對細胞的影響不同 在細胞受有害物污染時間短、污染程度輕、并能及時排除污染物的情況下，細胞 有可能 恢復。 當污染物持續(xù)存在于培養(yǎng)環(huán)境中時， 輕者 細胞增殖生長緩慢、分裂相減少、細胞變得粗糙、細胞輪廓增強，重者 細胞停止增殖，分裂相消失，細胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物，細胞變圓或崩潰從瓶壁脫落。 無 毒 ： 無毒是培養(yǎng)細胞的必需條件。凡與細胞 直接或間接接觸的東西都必須是無毒的。 無污染 不同細胞類型的交叉污染 微生物的污染 細菌 霉菌 支原體等 空氣 /器材 /操作 /血清 /組織樣本 污染途徑 污染來源 不潔的動物組織標本 ? 很多動物組織本該是無菌的 ， 但取材時不小心也會有污染的機會 。 組織本身含有細菌 ， 如取材時不用濃的抗生素洗液洗滌浸泡 ， 也會帶菌 ， 造成細胞污染 。 空氣 ? 如果操作室與外界隔離不嚴或消毒不充分 ， 很容易造成污染 。 另外 ， 凈化工作臺使用過久 ， 濾板未定期更換或長久不更換 ， 濾網(wǎng)受塵埃堵塞 ， 工作時不帶口罩或外界氣流過強 ， 污染空氣進入操作區(qū) ， 也會導致污染 。 春夏季南方地區(qū)