浙江大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)-文庫(kù)吧資料
2025-05-06 01:25本頁(yè)面
【正文】 的培養(yǎng)液肉眼觀察無(wú)多少改變 ， 只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染 。 最常見(jiàn)的有 G+菌 ， 其中又以白色葡萄球菌較常見(jiàn) ， 其次枯草桿菌 ， 大腸桿菌 、 假單胞菌等 G菌 。 操作 來(lái)自操作者的污染主要有以下幾方面： ? 器材和溶液使用前未仔細(xì)檢查是否污染過(guò) ， 或者是否已經(jīng)消毒滅菌處理過(guò) ， 或者雖經(jīng)處理 ， 時(shí)隔已久又末重新處理 ? 操作者未戴口罩 、 帽子 ， 呼氣中排出細(xì)菌和支原體 。 春夏季南方地區(qū)多雨 ， 空氣濕度大 ， 含菌量多 ，工作不注意也易污染 。 空氣 ? 如果操作室與外界隔離不嚴(yán)或消毒不充分 ， 很容易造成污染 。 無(wú)污染 不同細(xì)胞類型的交叉污染 微生物的污染 細(xì)菌 霉菌 支原體等 空氣 /器材 /操作 /血清 /組織樣本 污染途徑 污染來(lái)源 不潔的動(dòng)物組織標(biāo)本 ? 很多動(dòng)物組織本該是無(wú)菌的 ， 但取材時(shí)不小心也會(huì)有污染的機(jī)會(huì) 。 無(wú) 毒 ： 無(wú)毒是培養(yǎng)細(xì)胞的必需條件。 污染對(duì)細(xì)胞的影響 根據(jù)污染物和污染程度的不同，對(duì)細(xì)胞的影響不同 在細(xì)胞受有害物污染時(shí)間短、污染程度輕、并能及時(shí)排除污染物的情況下，細(xì)胞 有可能 恢復(fù)。 主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺(tái)、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒 大容量高壓蒸汽滅菌器 全自動(dòng)手提式滅菌器 移液器 含有兩個(gè)室，每個(gè)室被劃分為 9個(gè)方陣，其中 4個(gè)方陣有 16個(gè)小方格，為 mm3 或 1 104 ml，細(xì)胞濃度取決于已知體積中的細(xì)胞數(shù)。 學(xué)生正在進(jìn)行細(xì)胞觀察 倒置顯微鏡 倒置顯微鏡 用于烘干和干熱消毒玻璃器皿（ 160 ℃ ， 2 h）。 ? 保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈，定期消毒（紫外線、酒精）。 注意檢查是否堵塞！（看酒精燈） 外流式 （基本不用） 側(cè)流式 直流式 超凈工作臺(tái)結(jié)構(gòu)和模式圖 生物安全柜 CO2培養(yǎng)箱 ? CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為 37 ℃ ，5％ CO2， 85%濕度。 玻璃器皿 玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管和吸管、離心管、其它 塑料器皿 培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、多孔培養(yǎng)板、移液管、離心管、注射器、其它 超凈工作臺(tái)(clean bench) 利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣通過(guò)高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。其基本條件是： 清潔、無(wú)菌、干燥、不通風(fēng)，并具有適宜的光線。 谷氨酰胺補(bǔ)充液 （二）細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)備條件 一定的密閉性 通風(fēng)透氣良好 ， 但不會(huì)因此造成室內(nèi)污染 適合于消毒 方便進(jìn)出但不會(huì)因此而影響無(wú)菌室的 “ 無(wú)菌性 ” ， 保證工作空間的 “ 絕對(duì) ” 無(wú)菌 一般包括：準(zhǔn)備室 、 培養(yǎng)室和緩沖室 無(wú)菌室的條件 準(zhǔn)備室： 用于進(jìn)行培養(yǎng)器皿的清洗、包裝、培養(yǎng)物質(zhì)的準(zhǔn)備和消毒以及供應(yīng)物品的保藏等。 抗生素液 各種抗生素使用情況 抗生素 作用對(duì)象 參考濃度 (ug/ml) 穩(wěn)定性 (d) 兩性霉素 B 真菌 1 3 氨芐青霉素 G+， G 100 3 氯霉素 G 5 5 紅霉素 G+，支原體 100 3 慶大霉素 G+， G，支原體 50 5 卡那霉素 G+， G 100 5 制霉菌素 真菌 50 3 青霉素 G G+ 100IU/ml 3 鏈霉素 G 100 3 福利平 G 50 3 四環(huán)素 G+， G，支原體 10 4 使用終濃度為 2 mM。使用時(shí)可向 100 ml培養(yǎng)液中加入 1 ml Hepes儲(chǔ)存液，終濃度為 10 mmol/L 青鏈霉素溶液 俗稱雙抗溶液，青霉素對(duì) G+菌有效，使用終濃度為10萬(wàn) U/L，鏈霉素對(duì) G菌有效， 使用終濃度為。 主要作用 : 防止培養(yǎng)基 pH迅速變動(dòng)。當(dāng) pH值過(guò)高后，可用滅菌的 10％醋酸溶液或通入 CO2氣體調(diào)節(jié)。 pH調(diào)整液 NaHCO3 溶液 常用濃度為 %。故 NaHCO3都是單獨(dú)配制，高壓滅菌。2Na 溶液 一種化學(xué)螯合劑，對(duì)細(xì)胞有一定的離散作用，而且毒性小，價(jià)格低廉，使用方便 常用工作液濃度為 %。 膠原酶溶液 一般為 mg/L或 20萬(wàn) U/L，最佳 pH為 ，膠原酶不受Ca2+、 Mg2+及血清的抑制，配制時(shí)可用 PBS。2H2O KH2PO4 NaHCO3 葡萄糖 酚紅 胰酶 (trypsin)溶液 一般濃度為 %，配制時(shí)用平衡鹽溶液，溶解的最佳 pH是 89，充分溶解后過(guò)濾除菌，可再調(diào)整 pH至 。7H2O Na2HPO4s Dulbecco NaCl KCl CaCl2 MgCl2 其它培養(yǎng)用液 平衡鹽溶液 消化液 pH調(diào)整液 抗生素液 谷氨酰胺補(bǔ)充液 幾種常用的平衡鹽溶液的配方 (g/L) Binger PBS Tyrode Earle Hank39。 ［ 附 ］ RPMI1640生長(zhǎng)液和維持液配法 維持液： RPMI1640 95％ 小牛血清 2％ 谷氨酸胺（ 100 ） 1％ 雙抗（ 100 ） 1％ 用 NaHCO3調(diào) pH至 。 在一些特殊培養(yǎng)液中不含酚紅 ? 哺乳細(xì)胞培養(yǎng)液：酚紅能模擬類固醇激素（尤其是雌激素）樣作用 ? 流式檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液：酚紅干擾檢測(cè) 維持液與生長(zhǎng)液 維持液：合成培養(yǎng)基中不加血清或加低濃度（如 2％）血清，僅能維持細(xì)胞生存，細(xì)胞不能很好生長(zhǎng)。 NaHCO谷氨酰胺等物質(zhì)要在培養(yǎng)基完全溶解后才能添加； 3）配制所用的水為雙蒸水或三蒸水，離子濃度很低； 4）所用器皿應(yīng)潔凈無(wú)菌； 5）配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過(guò)濾除菌，存于 20 oC或 4 oC。 無(wú)蛋白培養(yǎng)基 (protein free medium, PFM) 限定化學(xué)成分培養(yǎng)基 (chemical defined medium, CDM)： 培養(yǎng)基的選擇 1）建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)是首選，可查閱文獻(xiàn)或向賣家咨詢； 2）本實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)基，許多培養(yǎng)基可適合于多種細(xì)胞； 3）根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要選擇培養(yǎng)基； 如小鼠細(xì)胞株多選 RPMI1640，進(jìn)行細(xì)胞雜交、轉(zhuǎn)染可選 IMDM 4）用多種培養(yǎng)基分別培養(yǎng)目的細(xì)胞，根據(jù)其生長(zhǎng)狀態(tài)選擇培養(yǎng)基。s 5A medium： 一般以 HamF12和 DMEM按 1:1混合作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液； 在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加促貼壁物質(zhì)、促生長(zhǎng)因子及激素、酶抑制劑、結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、微量元素等。 HamF HamF12 medium： 由 MeCoy 等人專為肉瘤細(xì)胞研制的培養(yǎng)液，后發(fā)現(xiàn)特別適合原代細(xì)胞培養(yǎng)，尤其是較難培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)。 109比 199效果更好。s medium)： 由 Moor等人為培養(yǎng)小鼠的白血病細(xì)胞而設(shè)計(jì)，特別適合懸浮細(xì)胞，尤其是淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)，組分較簡(jiǎn)單，目前配方適合多種細(xì)胞的生長(zhǎng)。 IMDM (Iscove39。s modified Eagle medium)： 由 Iscove等人在 DMEM基礎(chǔ)上增加了許多非必需氨基酸及一些維生素，增加了 HEPES，葡萄糖含量為高糖型。附著較困難的腫瘤細(xì)胞。成分簡(jiǎn)單，易于添加某種特殊成分適應(yīng)某些特殊細(xì)胞的培養(yǎng)。 使用濃度 一般為 520%，最常用為 10%。 ? pH： 大多數(shù)細(xì)胞的適宜 pH為 . ? 無(wú)毒、無(wú)污染 培養(yǎng)基的種類 ? 天然培養(yǎng)基 ： 血清 ? 合成培養(yǎng)基 ： 主要是牛血清 胎牛血清： 取自破腹產(chǎn)的胎牛
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