【文章內(nèi)容簡介】 ? 分裝試管（ 45cm） ? 3個試管 ? 伏普實驗 細菌細胞的生理生化反應 淀粉的水解實驗 固體淀粉培養(yǎng)基滅菌后冷卻至 50℃, 倒平板； 記號筆將平板分區(qū)，不同的區(qū)域接種不同的菌種，記錄接種的菌種名； 平板倒置在 37℃ 培養(yǎng) 24h。 將平板打開，加入 Lugol’ s碘液，輕旋轉(zhuǎn)，觀察結果。 細菌細胞的生理生化反應 糖發(fā)酵實驗 ?實驗步驟 取半固體葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管３支，分別用接種針穿刺接入大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和陰性對照，37 ℃ 培養(yǎng) 24h。 ?觀察記錄 與對照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原有顏色，其反應結果為陰性，表明該菌不能利用該種糖，記錄用 “ － ” 表示；如培養(yǎng)液呈黃色，反應結果為陽性，表明該菌能分解該種糖產(chǎn)酸，記錄用 “ ＋ ” 表示。培養(yǎng)液中有氣泡為陽性反應，表明該菌分解糖能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，記錄用 “ ＋ ” 表示；如管內(nèi)沒有氣泡為陰性反應，記錄用 “ － ” 表示。 細菌細胞的生理生化反應 吲哚實驗 ?實驗步驟 用接種環(huán)分別接種大腸桿菌、枯草芽孢桿菌到含有蛋白胨水培養(yǎng)基的 2支試管中 ,將試管置37℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48h。向培養(yǎng)后的蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)加 34滴乙醚，搖動數(shù)次，靜置 3min,待乙醚上升后，沿試管壁緩慢加入 2滴吲哚試劑。 ?觀察記錄 在乙醚與培養(yǎng)物之間產(chǎn)生紅色環(huán)狀物的，為陽性反應，否則為陰性。 細菌細胞的生理生化反應 VP test（乙酰甲基甲醇試驗） 以無菌操作分別將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌分別接種于 2支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基（ VP test），空白對照管不接菌，置 37℃ 恒溫箱中，培養(yǎng)。培養(yǎng) 2d后，將培養(yǎng)物內(nèi)加入 510滴 40%KOH,然后加入等量的 5% α 奈酚溶液，用力振蕩，在放入 37保溫 1530 min, 若培養(yǎng)物呈紅色，為 VP test 陽性。 細菌細胞的生理生化反應 檸檬酸鹽利用實驗 ?將大腸桿菌和枯草芽孢桿菌分別接種于 2支檸檬酸鹽斜面上，置于 37℃ 培養(yǎng) 2448小時。 ?觀察檸檬酸鹽培養(yǎng)基上有無細菌生長和是否變色，斜面呈藍色的是陽性反應，呈綠色的為陰性反應。 細菌細胞的生理生化反應 硫化氫產(chǎn)生實驗 ?將大腸桿菌和枯草芽孢桿菌分別穿刺接種于 2支半固體培養(yǎng)基中，置于 37℃ 培養(yǎng) 2448小時。 ?觀察結果，如培養(yǎng)基中出現(xiàn)黑色沉淀線者，為陽性反應。 細菌細胞的生理生化反應 注意事項 實驗中無菌操作。 吲哚實驗中加入乙醚時要緩慢的加入。 培養(yǎng)時間達到要求時間，現(xiàn)象明顯。 配制氫氧化鉀時，要注意不要腐蝕皮膚和實驗臺。 細菌細胞的生理生化反應 酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計數(shù)及死活細胞的鑒定 相關理論知識 ?酵母菌形態(tài) 酵母菌是單細胞真核微生物。酵母菌細胞的形態(tài)通常有球形、卵圓形、臘腸形、橢圓形、檸檬形或藕節(jié)形等。比細菌的單細胞個體要大得多。酵母菌無鞭毛，不能游動。 酵母菌具有典型的真核細胞結構 ,有細胞壁、細胞膜、細胞核、細胞質(zhì)、液泡、線粒體等，有的還具有微體。 酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計數(shù)及死活細胞的鑒定 單細胞的酵母菌 面包酵母（長有芽孢） 酵母菌的出芽生殖 含有細菌真菌菌絲和酵母菌 酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計數(shù)及死活細胞的鑒定 相關理論知識 ?酵母菌菌落特征 大多數(shù)酵母菌的菌落特征與細菌相似，但比細菌菌落大而厚，菌落表面光滑、濕潤、粘稠，容易挑起，菌落質(zhì)地均勻，正反面和邊緣、中央部位的顏色都很均一，菌落多為乳白色，少數(shù)為紅色，個別為黑色。 啤酒酵母的菌落 紅酵母的菌落 各種酵母菌的菌落 酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計數(shù)及死活細胞的鑒定 相關理論知識 ?酵母菌的無性繁殖 ? 芽殖 酵母菌最常見的無性繁殖方式是芽殖。芽殖發(fā)生在細胞壁的預定點上，此點被稱為芽痕，每個酵母細胞有一至多個芽痕。成熟的酵母細胞長出芽體，母細胞的細胞核分裂成兩個子核，一個隨母細胞的細胞質(zhì)進入芽體內(nèi)，當芽體接近母細胞大小時，自母細胞脫落成為新個體，如此繼續(xù)出芽。如果酵母菌生長旺盛，在芽體尚未自母細胞脫落前，即可在芽體上又長出新的芽體，最后形成假菌絲狀。 ?裂殖 裂殖是少數(shù)酵母菌進行的無性繁殖方式，類似于細菌的裂殖。其過程是細胞延長，核分裂為二，細胞中央出現(xiàn)隔膜，將細胞橫分為兩個具有單核的子細胞。 酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計數(shù)及死活細胞的鑒定 酵母菌的芽殖過程 1． 泡； 2． 小管； 3． 核； 4． 液泡 酵母菌假菌絲的形成 圖中 4 是出芽的順序 酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計數(shù)及死活細胞的鑒定 相關理論知識 ?酵母菌的有性繁殖 酵母菌是以形成子囊和子囊孢子的方式進行無性繁殖的。兩個臨近的酵母細胞各自伸出一根管狀的原生質(zhì)突起，隨即相互接觸、融合，并形成一個通道，兩個細胞核在此通道內(nèi)結合，形成雙倍體細胞核，然后進行減數(shù)分裂，形成 4個或 8個細胞核。每一子核與其周圍的原生質(zhì)形成孢子，即為子囊孢子，形成子囊孢子的細胞稱為子囊。 酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計數(shù)及死活細胞的鑒定 相關理論知識 酵母菌子囊孢子的形成過程 4：兩個細胞結合； 5：接合子； 9：核分裂； 11：核形成孢子 酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計數(shù)及死活細胞的鑒定 顯微計數(shù)法 顯微計數(shù)法適用于各種含單細胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)，常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數(shù)板，一般細菌則采用彼得羅夫 霍澤（ Petrof Hausser）細菌計數(shù)板。兩種計數(shù)板的原理和部件相同，只是細菌計數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數(shù)板較厚，不能使用油鏡。 酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計數(shù)及死活細胞的鑒定 血球計數(shù)板 血球計數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片 上有 4條槽而構成 3個平臺。中間的平臺較寬，其中 間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一 個計數(shù)區(qū)，計數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計數(shù)區(qū)分 為 16個大方格（大方格用三線隔開），而每個大方 格又分成 25個小方格；另一種是一個計數(shù)區(qū)分成 25 個大方格（大方格之間用雙線分開），而每個大方 格又分成 16個小方格。但是不管計數(shù)區(qū)是哪一種構 造，它們都有一個共同特點，即計數(shù)區(qū)都由 400個小 方格組成。 酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計數(shù)及死活細胞的鑒定 血球計數(shù)板特征 酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計數(shù)及死活細胞的鑒定 目的要求 觀察酵母菌的形態(tài)特征及出芽方式。 了解血球計數(shù)板構造及計數(shù)原理，掌握 顯微計數(shù)的原理及方法 。 學習鑒別死活細胞的方法。 酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計數(shù)及死活細胞的鑒定 實驗原理 ?酵母菌觀察 酵母菌是單細胞真核生物，菌體比細菌大且不運動。繁殖方式以無性為主（芽殖或裂殖），有性繁殖產(chǎn)生子囊和子囊孢子。 ?直接計數(shù)法 直接計數(shù)法是利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。 ?死活細胞鑒定 美藍是一種無毒性的染料，它的氧化型呈藍色，還原型為無色。用美藍對酵母活細胞染色時，由于細胞的新陳代謝作用，細胞內(nèi)具有較強的還原能力，能使美藍由藍色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型，而對代謝作用微弱或死細胞，無此還原能力或還原能力極弱，而被美藍染成藍色或淡藍色。因此不僅用此法可以觀察酵母細胞的形態(tài)，也可用來鑒別酵母菌的死細胞和活細胞。 酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計數(shù)及死活細胞的鑒定 試劑與器材 材料 釀酒酵母 試劑 %和 %的呂氏堿性美藍液、革蘭氏染色用 的碘液。 器材 顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、酒精燈等。 酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計數(shù)及死活細胞的鑒定 實驗步驟（ 1） ?死活細胞鑒定（美藍浸片觀察） ?在載玻片中央加一滴 ％美藍染色液，挑菌混勻； ?傾斜緩慢放置蓋玻片； ?放置 3min后鏡檢； ?染色半小時后再次進行觀察，注意死活細胞數(shù)量是否增加； 酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計數(shù)及死活細胞的鑒定 實驗步驟（ 2） ?計數(shù)實驗 ?鏡檢計數(shù)室，去污，清洗，吹干； ?裝目鏡測微尺，刻度朝下； ?校正目鏡測微尺（高倍鏡下兩重合線之間兩尺分別所占的格數(shù)） ?校正后取下鏡臺測微尺，換上細菌染色制片。 ?蓋上蓋玻片，菌懸液于邊緣滴一小滴，滲入，使充滿菌液； 酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計數(shù)及死活細胞的鑒定 ?顯微鏡計數(shù) 加樣后靜止 5min，每個小格內(nèi) 5－ 10個菌體，取 5個中格（可選 4個角和中央的一個中格）計數(shù)；代入公式計算結果。 1ml菌液中的總菌數(shù)＝ N/5 x 25 x 10x M(N為 5個中方格中總菌數(shù)， M為菌液稀釋倍數(shù)） ?清洗。 酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計數(shù)及死活細胞的鑒定 實驗結果 酵母菌的顯微鏡下的形態(tài)結構 酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計數(shù)及死活細胞的鑒定 注意事項 酵母菌制片時，菌體不能過多。 染色時間要掌握好。 血球計數(shù)板清洗是不能用手或者別的硬物擦拭。 顯微測量時要校對目鏡測微尺。 酵母菌的培養(yǎng)、形態(tài)觀察、直接計數(shù)及死活細胞的鑒定 放線菌與霉菌的形態(tài)觀察 相關理論知識（ 1） 放線菌 (Actinomycetes)是一群絲狀， G+的細 菌，在氣生菌絲末端形成孢子。細胞壁主要成分 是肽聚糖，最適 pH與細菌相似。主要以孢子方式 進行無性繁殖。其 DNA 堿基組成中 GC含量特別高， 超過任何已知的細菌。 許多臨床應用的抗生素都由鏈霉菌種產(chǎn)生。已 知放線菌能夠產(chǎn)生 500多種抗生素。大多數(shù)抗生素對 不同的細菌有獨特的療效，有 50多種被實際應用 放線菌與霉菌的形態(tài)觀察 相關理論知識（ 2） 放線菌是單細胞的原核生物。與其它的原核生物不同的是，放線菌的菌體一般由分枝狀的菌絲構成，菌絲的寬度在 1 um左右。放線菌的菌絲可以分為兩類：伸入到培養(yǎng)基內(nèi)部的菌絲稱為基內(nèi)菌絲，主要功能是吸收營養(yǎng)物質(zhì)；伸展在空氣中的菌絲稱為氣生菌絲，這