應(yīng)用生物質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)磷酸化位點-生物質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)磷酸化位(編輯修改稿)
2025-05-01 23:21 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 飛行時間質(zhì)譜儀(Autoflex，Bruker)。2．方法1) 蛋白的溶液酶切：稱取標(biāo)準(zhǔn)磷酸化蛋白βcasein 50μg，溶于50μL 25mM NH4HCO3中。 加入分裝保存的胰蛋白酶1 ug，37℃，12h后取出部分稀釋成所需濃度備用。2) 離子親和層析IMAC法富集磷酸化肽段：①％乙酸／50％乙腈／水溶液洗3次，②用200mM Ga(NO3)3溶液洗10次，③用超純水洗3次，④用1％乙酸／10％乙腈／水溶液洗3次， ⑤％乙酸／10％乙腈／水溶液洗5次，⑥蛋白質(zhì)酶解混合物用酸性溶液（20％乙酸或1％甲酸水溶液）調(diào)pH至2以下，用ZipTipMC吸取、排出10次以上，⑦％乙酸／10％乙腈／水溶液洗6次，⑧用超純水洗3次，⑨2－3μL ；3) 質(zhì)譜分析： 電噴霧質(zhì)譜儀為英國Micromass公司的電噴霧四極桿正交加速飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀QTOF2。配備毛細(xì)管液相色譜和納升噴霧源。鍍金屬鈀的硼硅酸鹽電噴霧針（palladiμmcoated borosilicate electrospray needle）(Protana, Odense, Denmark)是一次性使用的專用needle。碰撞氣體為氬氣。源溫80176。C，錐孔電壓50V左右。TOF 。MCP 檢測器電壓為2200V。當(dāng)進(jìn)行手動測序時，毛細(xì)管電壓為8001200V可得到穩(wěn)定的噴霧。調(diào)節(jié)碰撞能量和碰撞氣體的大小使得到一個好的串聯(lián)質(zhì)譜圖。該質(zhì)譜圖經(jīng)Micromass的專用軟件MaxEnt3處理后，用Micromass的專用軟件MasSeq直接推倒出肽段序列。Nanoflow probe進(jìn)樣毛細(xì)管電壓
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