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應(yīng)用生物質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)-生物質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)磷酸化位(更新版)

2025-05-13 23:21上一頁(yè)面

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【正文】 AB圖3：2pmol/μl胰酶酶解混合物ZipTipMC處理前后的肽指紋譜。該段序列為牛βcasein 前體蛋白的48 – 63位氨基酸序列?；|(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀為Bruker公司的Autoflex，%TFA中，取1μL與飽和CCA基質(zhì)上清液混合，取1181。TOF 。2．方法1) 蛋白的溶液酶切：稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)磷酸化蛋白βcasein 50μg，溶于50μL 25mM NH4HCO3中。這兩種方法的建立和成熟運(yùn)用將為磷酸化蛋白的研究提供便利條件。是唯一能夠與蛋白質(zhì)組研究水平相匹配的方法。兩種方法具有不同的特點(diǎn)及局限性，具體研究中還要視具體情況優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。應(yīng)用這兩種方法均可將從蛋白質(zhì)酶切混合物中找出磷酸化肽段，進(jìn)而通過(guò)序列分析定位磷酸化位點(diǎn)。生物質(zhì)譜（MS）是揭示蛋白質(zhì)許多翻譯后修飾和蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析的一個(gè)不可缺少的工具，所用的蛋白質(zhì)樣品量在fmol水平。目前微量IMAC 預(yù)裝柱ZipTipMC已經(jīng)商品化，可以方便的與Nanospray微量分析系統(tǒng)相匹配。基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Autoflex，Bruker)。C，錐孔電壓50V左右。中性丟失掃描：設(shè)定掃描范圍400－2000，掃描方式為中性丟失掃描，尋找中性丟失49的雙電荷離子。將儀器切換至正離子MS/MS模式下，（圖2）FQSEEQTEDELQDK其中S為磷酸化的絲氨酸。結(jié)果表明經(jīng)濃度為2pmol/μL 以上的樣品ZipTipMC處理之后的樣品中非磷酸化肽段幾乎全部被除去，磷酸化肽段信號(hào)顯著增強(qiáng)；低于此濃度的樣品經(jīng)處理后質(zhì)譜圖中無(wú)磷酸化肽信號(hào)。66 /

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