應用生物質譜分析蛋白質磷酸化位點-生物質譜分析蛋白質磷酸化位(完整版)
【正文】 品。近年來，生物質譜的發(fā)展顯著地促進了對具有生物學功能的磷酸化蛋白質的研究，是國際上當前最重要的一個前沿領域，也是目前蛋白質組研究的一個重要方面。蛋白質可逆磷酸化是最普遍、最重要的一種蛋白質翻譯后修飾（PTM）。我們用天然磷酸化蛋白建立了中性丟失掃描和固相金屬親和色譜（IMAC）兩種基于質譜的磷酸化蛋白分析方法。毛細管電泳（CE）可以分析蛋白質或多肽的磷酸化及磷酸化氨基酸，但是鑒定蛋白質磷酸化位點首先要用高效液相色譜（HPLC）分離蛋白的酶解肽段，然后用CE篩測磷酸化肽，最后用自動Edman降解氨基酸分析法確定其磷酸化位點，工作量大，不是快速和高通量分析方法。固相金屬親和色譜（IMAC）法是近年來應用最廣泛的特異性富集磷酸化肽段的方法，該方法適用于微量復雜樣品的處理。儀器：電噴霧四極桿飛行時間串聯(lián)質譜儀（QTof2，Micromass），配有masslynx數(shù)據(jù)系統(tǒng)。源溫80176。所有測定均在正離子方式下進行，用Glufib(sigma)的串聯(lián)質譜碎片校正，質量準確度177。圖中所示的肽段為掃描得到的磷酸化肽段，與βcasein理論酶切所得到的磷酸化肽段質荷比一致。2. IMAC法選擇性富集磷酸化肽段： 用1％甲酸水溶液將樣品稀釋為不同濃度（100fmol/μL, 500fmol/μL,2pmol/μL 5pmol/μL），各取 5μL分別用鉫離子親和色譜ZipTipMC處理，洗脫后取1μL 直接進行MAILDTof質譜檢測，結果見圖3。但不同方法在進行磷酸化分析時各有優(yōu)點及局限性，在實際應用中應根據(jù)樣品情況和具體要求選擇應用何種方法及具體條件。
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