重組人促紅細(xì)胞生成素的分離純化工藝(編輯修改稿)
2025-02-17 16:00 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 明，并證實(shí)從柱上不會(huì)掉下有害物質(zhì)。上樣前應(yīng)清洗除去熱源等。純化工藝的每一步均應(yīng)測(cè)定純度，計(jì)算提純倍數(shù)、收率等。純化工藝過(guò)程中應(yīng)盡量不加入對(duì)人體有害的物質(zhì)，若不得不加時(shí)，應(yīng)設(shè)法除凈，并在最終產(chǎn)品中檢測(cè)殘余量，應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于有害劑量，同時(shí)還要考慮到多次使用的積蓄作用。 三、純化工藝過(guò)程的質(zhì)量控制 目前有許多方法可用于對(duì)重組技術(shù)所獲得蛋白質(zhì)藥物進(jìn)行全面 鑒定 ，如用各種電泳技術(shù)分析、高效液相色譜分析、肽圖分析、氨基酸成分分析、部分氨基酸序列分析及免疫學(xué)分析的方法等。 四、對(duì)最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制主要包括 產(chǎn)品的鑒 別 、 純度 、 活性 、 安全性 、 穩(wěn)定性 和 一致性 。 對(duì)其純度測(cè)定通常采用的方法有還原性及非還原性 SDSPAGE、等電聚焦、各種 HPLC、毛細(xì)管電泳等，需有兩種以上不同機(jī)制的分析方法相互佐證，以便對(duì)目的蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)；在其雜質(zhì)控制上要檢測(cè)內(nèi)毒素、熱原、宿主細(xì)胞蛋白、殘余 DNA等。 對(duì)其 生物活性 需采用國(guó)際或國(guó)家參考品，或經(jīng)過(guò)國(guó)家鑒定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的參比品，以體內(nèi)或細(xì)胞法測(cè)定制品的生物學(xué)活性，并標(biāo)明其活性單位；在安全性上需按照“中國(guó)生物制品規(guī)程”進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)、熱原試驗(yàn)、毒性和安全試驗(yàn)。 由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，可能同時(shí)存在多種降解途徑，因此須在實(shí)際條件下長(zhǎng)期觀測(cè)穩(wěn)定性，對(duì)產(chǎn)品 一致性、純度、分子特征和生物效價(jià) 等多方面的變化情況加以綜合評(píng)價(jià)，確定產(chǎn)品的貯藏條件和使用期限等。 下面介紹幾種臨床上極為重要的重組藥物如干擾素、生長(zhǎng)素、胰島素等的生產(chǎn)技術(shù)及工藝。 重組人干擾素概述 干擾素（ interferon， IFN）是機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一類(lèi)細(xì)胞因子，是機(jī)體受到病毒感染時(shí)，免疫細(xì)胞通過(guò)抗病毒應(yīng)答反應(yīng)而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類(lèi)似、功能接近的生物調(diào)節(jié)蛋白。 根據(jù)干擾素來(lái)源及其基因序列和氨基酸組成不同，可將干擾素分為 Ⅰ 型和 Ⅱ 型。 Ⅰ 型干擾素的表達(dá)細(xì)胞來(lái)源類(lèi)似，包括干擾素 α、 β、 ω、 τ和 λ。用病毒等刺激外周血漿樣樹(shù)突細(xì)胞（ pDCs）可以產(chǎn)生干擾素 α、 β、 ω的 13種亞型， 3種干擾素 τ亞型和干擾素 λ，但是沒(méi)有 Ⅱ 型干擾素 γ。 干擾素的生物學(xué)活性相當(dāng)廣泛，主要包括廣譜抗病毒活性、直接抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)活性。 ：①不能殺死病毒，只能抑制；②對(duì)病毒沒(méi)有直接的作用，通過(guò)細(xì)胞核內(nèi)的基因產(chǎn)生蛋白質(zhì)因子發(fā)揮作用，因此不同細(xì)胞對(duì)干擾素的敏感不同；③病毒大量復(fù)制時(shí)引發(fā)細(xì)胞炎癥應(yīng)答，此時(shí)易產(chǎn)生作用；④當(dāng)病毒 DNA已整合到宿主細(xì)胞的染色質(zhì)中時(shí)，干擾素不能發(fā)揮其抗病毒活性。 ： ① 直接抑制腫瘤細(xì)胞； ②調(diào)節(jié)宿主抗腫瘤免疫反應(yīng)；③改變宿主與腫瘤細(xì)胞的關(guān)系。 3．干擾素的免疫調(diào)節(jié)活性①對(duì)免疫監(jiān)視系統(tǒng)②對(duì)免疫防衛(wèi)系統(tǒng)③對(duì)免疫自穩(wěn)系統(tǒng)的調(diào)節(jié) 干擾素的臨床應(yīng)用廣泛。干擾素在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中起著非常重要的作用，在同種細(xì)胞上具有廣譜抗病毒、抗細(xì)胞分裂和免疫調(diào)節(jié)等多種生理活性。 （ 1）抗病毒 干擾素 α/β能誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)多種肝炎病毒、鼻病毒、人乳頭瘤病毒、艾滋病病毒和多種RNA病毒產(chǎn)生抵抗力。（ 2）治療腫瘤 干擾素是一種較理想的腫瘤抑制蛋白，它能調(diào)節(jié)正常的和惡性化的細(xì)胞生長(zhǎng)和分化。 （ 3）其它應(yīng)用 有報(bào)道用干擾素治療精子缺乏癥、多發(fā)性硬化癥、黃斑變性癥等。 重組人干擾素生產(chǎn)技術(shù)和工藝 重組人干擾素的生產(chǎn)主要包括 工程菌的構(gòu)建 、 發(fā)酵 、 發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化 及 制劑加工 等單元操作技術(shù)和工藝。 一、工程菌的構(gòu)建 （ 1）干擾素基因的克隆 （ 2）干擾素表達(dá)載體的構(gòu)建（ 3）基因工程菌應(yīng)具備的特性：①革蘭陰性，桿狀，長(zhǎng)度 3～ 5μm。 30℃ 培養(yǎng) 24h，其菌落為～ ，灰綠色半透明狀，具有粘稠性。②不能將明膠、淀粉液化為可溶性單糖，不能利用進(jìn)行厭氧呼吸，能夠合成熒光色素。菌株為蘇氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型，可以利用 L纈氨酸作為碳源。③遺傳特性 DNA 中 G+C含量為 63%。細(xì)胞中攜帶 pVG3質(zhì)粒，具有硫酸鏈霉素、鹽酸四環(huán)素和氨芐青霉素的抗性。④放射性免疫學(xué)效價(jià)不能低于 109IU/L。 （ 4）菌種庫(kù)的建立及保存（ 5）工作菌種庫(kù)的建立及保存 二、重組人干擾素 α2b的發(fā)酵工藝及過(guò)程控制 生產(chǎn)菌種 接種 菌種活化 種子罐培養(yǎng) 發(fā)酵罐培養(yǎng) 發(fā)酵液降溫 菌體搜集 離心 菌體冷凍保存 蒸汽滅菌 蒸汽滅菌 配制培養(yǎng)基 原料 蒸汽滅菌 (1)假單胞桿菌的生長(zhǎng)和干擾素的生產(chǎn)基本處于不相關(guān)狀態(tài)。 (2)一般的，種子培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分宜豐富些，尤其是氮源的含量應(yīng)較高（即 C/N低）。 (3)發(fā)酵要求培養(yǎng)液中有足夠的溶解氧，為了提高發(fā)酵罐的供養(yǎng)能力，往往需要增大攪拌轉(zhuǎn)速，增加空氣流量，或通
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