暑假中學骨干生物教師培訓基因工程和細胞工程(編輯修改稿)
2025-02-14 01:40 本頁面
【文章內容簡介】 目的基因的獲得通常采用 PCR法；化學合成法由于合成的片段較短，一般用于引物和探針的合成；基因文庫一般用于保存基因資源。 目的基因檢測與鑒定 ? 通常采用 分子雜交 的方法。 ? 分子雜交：采用已知標記的核酸分子或蛋白質分子檢測混合樣品中未知核酸分子或蛋白質分子。 ? 根據(jù)其檢測對象的不同可分為 Southern 雜交（ DNA）、 Northern 雜交 （ RNA）和 Western 雜交 （蛋白質） 。 ? 分子雜交可在 DNA與 DNA、 RNA與 RNA或 RNA與DNA的二條單鏈之間進行，也可以在蛋白質與蛋白質之間進行。 ? 核酸分子雜交是指核酸分子 (DNA或 RNA)在變性以后，在復性的過程中兩個不同來源的且同源的核酸分子形成雜合雙鏈的過程。 ? 蛋白質之間的雜交通過抗原抗體反應進行。 ? 通常通過各種方法將核酸（蛋白質）分子固定在固相支持物上，然后用放射性元素等標記的探針（抗體）與被固定的分子雜交，經顯影（顯色）后顯示出目的核酸（蛋白質）分子。 Southern雜交的操作步驟 ? (1) 酶切 DNA，凝膠電泳分離各酶切片段 ,然后使 DNA原位變性。 ? (2) 將 DNA片段轉移到固體支持物 (硝酸纖維素濾膜或尼龍膜 )上。 ? (3) 預雜交濾膜 ,掩蓋濾膜上非特異性位點。 ? (4) 讓探針與同源 DNA片段雜交，然后漂洗除去非特異性結合的探針。 ? (5) 通過顯影檢查目的 DNA所在的位置。 放射自顯影 DNA印跡轉移 探針雜交 － ＋ 將 RNA分子從電泳凝膠轉移到硝酸纖維素濾膜或其他化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法。 Northern雜交 Northern雜交的過程 ① 提取總 RNA ② 分離 mRNA， 利用親和層析的原理純化 mRNA。 ③ 制備 RNA探針 ， 根據(jù) mRNA序列合成同源 DNA探針 ，或以 cDNA為探針 。 ④ Northern雜交 ， 通過顯影檢查目的 DNA所在的位置 。 Southern雜交和 Northern雜交過程示意圖 Western雜交 ? 中文一般稱為蛋白質印跡技術。其基本原理是通過 特異性抗體 對凝膠電泳分離的細胞或生物組織 蛋白樣品 進行檢測。 ? Western Blot與 Southern雜交或 Northern雜交方法類似，但 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。 Western雜交過程 ? 經過 SDSPAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素膜）上，以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的目的蛋白。根據(jù)檢測結果，從而可得知被檢細胞內目的蛋白表達與否、表達量及分子量等情況。 第一步 抗體識別抗原 第二步 第二抗體識別第一抗體 第三步 顏色反應 Western雜交結果圖 建立文庫需要重組子的數(shù)目 ? N=ln(1P)/ln(11/n) ? N：重組子數(shù)目； ? P：文庫中包括任意 DNA片段的概率；
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