暑假中學(xué)骨干生物教師培訓(xùn)基因工程和細(xì)胞工程-文庫(kù)吧
2025-01-03 01:40 本頁(yè)面
【正文】 定保存、擴(kuò)增、篩選。 cDNA文庫(kù)的主要優(yōu)點(diǎn) ① cDNA文庫(kù)特別適用于某些 RNA病毒的基因組結(jié)構(gòu)研究及有關(guān)基因的克隆分離； ② cDNA文庫(kù)較小，易于篩選； ③ cDNA文庫(kù)可用于在細(xì)菌中表達(dá)真核生物的基因； ④ cDNA文庫(kù)結(jié)合基因組文庫(kù)可用于真核細(xì)胞 mRNA的結(jié)構(gòu)和功能研究。 cDNA克隆的主要的缺點(diǎn) ? cDNA文庫(kù)所包含的遺傳信息遠(yuǎn)少于基因組 DNA文庫(kù)，并且受細(xì)胞來(lái)源或發(fā)育時(shí)期的影響； ? cDNA文庫(kù)不能直接獲得基因內(nèi)含子序列和基因編碼區(qū)外大量調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能方面信息； ? 在 cDNA文庫(kù)中，高豐度 mRNA的 cDNA克隆所占的比例比較高，分離起來(lái)比較容易，而低豐度 mRNA的 cDNA克隆所占的比例則比較低，因此分離也就比較困難。 從基因文庫(kù)中篩選目的基因 ： 核酸雜交 (探針 ）和 PCR（引物） ： 免疫學(xué)檢測(cè) （抗原抗體反應(yīng)） 探針 ? 探針 是一小段帶標(biāo)記的單鏈 DNA或者 RNA片段（大約是 20到 500bp）， 用于檢測(cè)與其互補(bǔ)的核酸序列。 ? 最初是使用帶放射性的 DNA探針，通過(guò)放射自顯影來(lái)顯示位置。后來(lái)又發(fā)明了免疫探針?lè)ǎ瑢⑻结樅塑账岬膫?cè)鏈加以改造，探針雜交后，其側(cè)鏈可被帶有熒光標(biāo)記的抗體所識(shí)別，從而顯示出位置。 菌落原位雜交法（核酸雜交） ? 直接把菌落印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上 ,經(jīng)溶菌和變性處理后使 DNA暴露出來(lái)并與濾膜原位結(jié)合 ,再與特異性 DNA探針雜交 ,篩選出含有目的序列的菌落。 對(duì)應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽(yáng)性菌落。 特點(diǎn)： PCR篩選法 利用合適的引物 ， 以從初選出來(lái)的陽(yáng)性克隆中提出的質(zhì)粒為模板進(jìn)行 PCR， 通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物的電泳分析 ， 確定目的基因序列所在克隆 。 免疫篩選法 放射性抗體檢測(cè)法 濾膜（固定抗體） + 免疫沉淀檢測(cè)法 菌落 沉淀素 ? 高等生物的基因組 DNA十分復(fù)雜 ,單個(gè)基因在基因組或某個(gè)特定發(fā)育階段或特定組織中所占比例很小。因此，要想從龐大的基因組中分離某個(gè)特定的 未知基因 非常困難，因此 先把材料 DNA分成若干易于處理的片段，然后確定目標(biāo)序列在哪一片段，再進(jìn)一步從該片段尋找目標(biāo)序列，事情就變得容易了。 為什么要建基因文庫(kù)？ PCR法獲取目的基因 已知基因： ? 設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，直接從基因組 DNA（或文庫(kù)）中擴(kuò)增該目的基因。 未知基因： ? 參照其他物種中該基因的兩末端設(shè)計(jì)引物，從基因組 DNA（或文庫(kù)）中擴(kuò)增該目的基因； ? 依照其他物種中該基因的保守區(qū)段序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出一段 DNA，標(biāo)記為探針，從基因組文庫(kù)、cDNA文庫(kù)中釣出該基因。 ? PCR法獲取目的基因的 前提是： 要有足夠制備合適引物的信息 PCR法獲取目的基因優(yōu)點(diǎn) ? ：在有足夠引物信息的情況下，可直接從基因組 DNA中克隆目的基因，大大減少了基因分離的工作量； ? ：可從極微量的模板擴(kuò)增出目的片段； ? ：由于其靈敏度高和特異性強(qiáng)，極微量的材料或者混合的組織、部分已降解的 DNA材料都可以作為起始材料； ? 。 化學(xué)合成制備目的基因 ? 磷酸二酯法 ? 亞磷酸三酯法 獲取目的基因的方法 ? 一般來(lái)說(shuō)： ?
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