暑假中學骨干生物教師培訓基因工程和細胞工程-文庫吧
2025-01-03 01:40 本頁面
【正文】 定保存、擴增、篩選。 cDNA文庫的主要優(yōu)點 ① cDNA文庫特別適用于某些 RNA病毒的基因組結(jié)構(gòu)研究及有關(guān)基因的克隆分離； ② cDNA文庫較小，易于篩選； ③ cDNA文庫可用于在細菌中表達真核生物的基因； ④ cDNA文庫結(jié)合基因組文庫可用于真核細胞 mRNA的結(jié)構(gòu)和功能研究。 cDNA克隆的主要的缺點 ? cDNA文庫所包含的遺傳信息遠少于基因組 DNA文庫，并且受細胞來源或發(fā)育時期的影響； ? cDNA文庫不能直接獲得基因內(nèi)含子序列和基因編碼區(qū)外大量調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能方面信息； ? 在 cDNA文庫中，高豐度 mRNA的 cDNA克隆所占的比例比較高，分離起來比較容易，而低豐度 mRNA的 cDNA克隆所占的比例則比較低，因此分離也就比較困難。 從基因文庫中篩選目的基因 ： 核酸雜交 (探針 ）和 PCR（引物） ： 免疫學檢測 （抗原抗體反應(yīng)） 探針 ? 探針 是一小段帶標記的單鏈 DNA或者 RNA片段（大約是 20到 500bp）， 用于檢測與其互補的核酸序列。 ? 最初是使用帶放射性的 DNA探針，通過放射自顯影來顯示位置。后來又發(fā)明了免疫探針法，將探針核苷酸的側(cè)鏈加以改造，探針雜交后，其側(cè)鏈可被帶有熒光標記的抗體所識別，從而顯示出位置。 菌落原位雜交法（核酸雜交） ? 直接把菌落印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上 ,經(jīng)溶菌和變性處理后使 DNA暴露出來并與濾膜原位結(jié)合 ,再與特異性 DNA探針雜交 ,篩選出含有目的序列的菌落。 對應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落。 特點： PCR篩選法 利用合適的引物 ， 以從初選出來的陽性克隆中提出的質(zhì)粒為模板進行 PCR， 通過對PCR產(chǎn)物的電泳分析 ， 確定目的基因序列所在克隆 。 免疫篩選法 放射性抗體檢測法 濾膜（固定抗體） + 免疫沉淀檢測法 菌落 沉淀素 ? 高等生物的基因組 DNA十分復(fù)雜 ,單個基因在基因組或某個特定發(fā)育階段或特定組織中所占比例很小。因此，要想從龐大的基因組中分離某個特定的 未知基因 非常困難，因此 先把材料 DNA分成若干易于處理的片段，然后確定目標序列在哪一片段，再進一步從該片段尋找目標序列，事情就變得容易了。 為什么要建基因文庫？ PCR法獲取目的基因 已知基因： ? 設(shè)計合成一對引物，直接從基因組 DNA（或文庫）中擴增該目的基因。 未知基因： ? 參照其他物種中該基因的兩末端設(shè)計引物，從基因組 DNA（或文庫）中擴增該目的基因； ? 依照其他物種中該基因的保守區(qū)段序列設(shè)計引物，擴增出一段 DNA，標記為探針，從基因組文庫、cDNA文庫中釣出該基因。 ? PCR法獲取目的基因的 前提是： 要有足夠制備合適引物的信息 PCR法獲取目的基因優(yōu)點 ? ：在有足夠引物信息的情況下，可直接從基因組 DNA中克隆目的基因，大大減少了基因分離的工作量； ? ：可從極微量的模板擴增出目的片段； ? ：由于其靈敏度高和特異性強，極微量的材料或者混合的組織、部分已降解的 DNA材料都可以作為起始材料； ? 。 化學合成制備目的基因 ? 磷酸二酯法 ? 亞磷酸三酯法 獲取目的基因的方法 ? 一般來說： ?
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