碩士研究課現(xiàn)代分子生物學molecularapproachesinbioremediation胡忠(編輯修改稿)
2025-02-12 20:22 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 突變酶改變了多氯聯(lián)苯復(fù)合物的降解特異性區(qū)域。尤其是 Ile335Phe突變體在提高了降解多氯聯(lián)苯的能力外 ,還具備了降解 2,3雙加氧酶和 3,4雙加氧酶的活性。 ? Keenan等還獲得了活性提高 1 1 15倍的萘雙加氧酶 ,另外在單加氧酶的功能改進方面取得了較好的進展。 Family and genome shuffling for PCBs and pentachlorophenol(多環(huán)芳烴和五氯酚 ) ? Crameri等于 1998年首次提出“ DNA家族改組 ”的概念。他們發(fā)現(xiàn) ,采用傳統(tǒng)的 DNA改組方法雖然能完成定向進化的目的 ,但其中隨機產(chǎn)生的多為點突變 ,且有益突變頻率低 ,導致篩選工作艱巨且進展緩慢。 ? DNA家族改組 (DNA family shuffling)是以來自不同種屬的同源基因作為重排對象進行 DNA改組操作的技術(shù)。該技術(shù)打破不同種、屬間的遺傳界限 ,利用同源基因之間的同源序列進行 DNA改組 ,通過提高親本基因群中差異的組合頻率和改組子代的雜合度 ,以增加突變文庫的多樣性 ,提高突變文庫的質(zhì)量 ,進而有效地產(chǎn)生滿足需要的突變體。與其他 DNA改組技術(shù)相比 ,DNA家族改組技術(shù)不僅可以顯著加速有益突變的累積 ,還易于實現(xiàn)目的蛋白多種特性的共進化。 ? 進行基因組改組首先需要有一個含有各種不同正突變的基因組庫 (例如 :通過經(jīng)典的誘變育種得到目的性狀發(fā)生改進的不同的正突變菌株就構(gòu)成了所需的基因組庫 ),隨后通過原生質(zhì)體融合將這些正突變菌株的全基因組進行隨機重組 ,并篩選目的性狀得到進一步改進的菌株來進行下一輪基因組改組 ,這樣 ,通過循環(huán)多輪的隨機重組可以快速、高效地選育出表型得到較大改進的雜交菌種。 DNA家 族 改 組 的 經(jīng) 典 技 術(shù) 路 線 ? Kumamaru等對 KF707的bphA1（聯(lián)二苯雙加氧酶）基因和 Burkholderia LB400的 bphA基因進行了體外分子進化改造 ,提高了菌株對多氯聯(lián)苯的降解能力 ,還擴大了菌株的降解范圍。經(jīng)改組和篩選獲得的 bph突變基因在大腸桿菌細胞培養(yǎng) ,對乙苯、丁苯和異丙苯降解能力較野生型高。 successful uses ? Barriault等針對聯(lián)二苯雙加氧酶基因的片段進行改組。其中聯(lián)二苯雙加氧酶的同源基因片段分別來源于Burkholderia sp.,Comamonas testosteroni和Rhodococcus globerulus。研究者在較小的庫容內(nèi)篩選到的新酶不僅對 2, 2二氯聯(lián)苯、 3,3二氯聯(lián)苯和 4, 4二氯聯(lián)苯活力提高 ,而且對不易分解的 2, 6二氯聯(lián)苯也具有良好的氧化能力。 ? 基因組改組重組幾個菌株同源染色體可以提高整個生物體的活性。該方法已用于生物修復(fù)中五氯酚的降解，Dai等通過三輪基因組改組將 Sphingobilum chlorophenolicum對劇毒殺蟲劑五氯苯酚的耐受濃度提高了 10倍以上 ,并可將培養(yǎng)基中所含的 3mmolL 1五氯苯酚完全降解。 ? Vezina等借助 DNA家族改組技術(shù)探索了 苯雙加氧酶 BPDOs底物的立體專一性和結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系 ,獲得了對 2,2’ CB(2,2’ 二氯聯(lián)苯 )中 C5和 C6的氧化活性提高的新酶 S100、S149和 S151。其中 ,S100還能催化 2,2’ CB得到順 5,6二氧 5,6二羥基 2,2’ 二氯聯(lián)苯 ,而且能降解一些其野生型雙加氧酶所不能降解的苯、甲苯類單環(huán)芳香化合物 ,擴大了酶的底物范圍。 ? 我國的 Li等選取 15種硝化細菌 ,對其硝酸氧還酶的同源基因進行家族改組后獲得了生長速率加快的克隆 (平均代時 16 h18 h),同時氧還酶的酶活提高 10倍以上。 Metabolic engineering for chlorinated aliphatics ? 代謝工程 (metabo1ic engineering)又稱途徑工程 ,由著名生化工程專家 Bailey J E于 1991年首先提出 ,他將其定義為“采用重組DNA技術(shù) ,操縱細胞的酶、運輸及調(diào)節(jié)功能 ,達到提高或改善細胞活性的目的” ,并論述了代謝工程的應(yīng)用、潛力和設(shè)計。 ? 隨著代謝工程研究應(yīng)用的深入 ,現(xiàn)在將其定義為利用基因工程技術(shù) ,有目的地對細胞代謝途徑進行精確的修飾、改造或擴展、構(gòu)建新的代謝途徑 ,以改變微生物原有代謝特性 ,并與微生物基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合 ,提高目的代謝產(chǎn)物活性或產(chǎn)量、或合成新的代謝產(chǎn)物的工程技術(shù)科學。 ? 代謝工程的一個重要應(yīng)用領(lǐng)域就是構(gòu)建能夠降解有害物質(zhì)的微生物。 Lee等報道了雜交菌 Pseudomonas可以同時聚集苯、甲苯、二甲苯而不積累其代謝中間體 ? Suyama等構(gòu)建的雜交 Pseudomonas可以生長在碳氫培養(yǎng)基上并可以降解三氯乙烯。 ? Jung等構(gòu)建的菌株還能降解硝基苯類。 ? 這些都說明利用代謝工程構(gòu)建新的菌株能高效的降解多種有機污染物。 successful uses ? Arnold等利用山葵過氧化物酶 (HRP)可以將苯酚或兒茶酚等具有羥基的芳香族化合物連接成可發(fā)出熒光的二聚體的原理而開發(fā)了一種高通量的熒光數(shù)字成像篩選方法 ,這種方法可以快速從 DNA改組后得到的大量產(chǎn)物中篩選出活性得到提高的加氧酶 (該酶催化芳香族化合物的羥基化反應(yīng) )。 ? Rojo等成功改造了 Pseudomonas B13 ：將三種不同細菌的五種不同的代謝途徑重組于單個生物體進行甲酚和甲苯的降解。 ? 2氯甲苯是一種較難降解的氯代芳香族化合物。Haro等對 2氯甲苯的代謝降解途徑進行了深入的研究，并構(gòu)建了可以降解 2氯甲苯的假單胞工程菌。 ? Walker等將有機磷水解酶基因 opd和來自Pseudomonas Pseudomonas putida中得到能以對硫
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