碩士研究課現(xiàn)代分子生物學(xué)molecularapproachesinbioremediation胡忠-資料下載頁
2025-01-16 20:22本頁面
【正文】 sis， 2DE)是目前唯一能將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時(shí)分離與展示的分離技術(shù) 。 2DE是由 O’Farrell和Klose 于 1975年分別提出的 ， 在 2DE中 ， 蛋白質(zhì)首先根據(jù) 等電點(diǎn) 的不同在一向等電聚焦電泳中分離 ， 接著被轉(zhuǎn)移到二向 SDS聚丙烯酰胺凝膠上 ，再根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量大小不同被分離 。 由于電泳裝置的限制和載體兩性電解質(zhì)的特性 ， 使得 2DE的重復(fù)性很差 ， 很難制備大量重復(fù)性好的 2DE膠 。 20世紀(jì) 80年代初期出現(xiàn)的固相化 pH梯度 (immobilized pH gradient，IPG)等電聚焦電泳技術(shù) ． 使 2DE的重復(fù)性和上樣量大大改善 ， 不同實(shí)驗(yàn)室之間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以進(jìn)行比較 ， 加之后續(xù)的微量鑒定技術(shù)如 Edman微量測(cè)序技術(shù)以及質(zhì)譜技術(shù)靈敏度的提高 ， 使得 2DE獲得了廣泛的應(yīng)用 ， 成為蛋白質(zhì)組研究中首選的分離技術(shù) 。 盡管如此 ， 2DE技術(shù)仍存在許多不足 ， 如 膜蛋白 、 堿性蛋白 、 低豐度蛋白的分離與檢測(cè) 、 重復(fù)性以及規(guī)?；妥詣?dòng)化的問題 。 Silver stained 2D gels from tissue samples of rabbit hearts. 生物質(zhì)譜技術(shù) ? 發(fā)展歷程 ? 七十年代初用于小分子分析鑒定的電離技術(shù)，如：電子轟擊 (Electron impact, EI)電離和化學(xué)電離 (Chemical ionization, CI)技術(shù)等。 質(zhì)量分析器主要為磁場(chǎng)分析器 (magic Sector)。 ? 七十年代末、八十年代初出現(xiàn)了場(chǎng)解吸 (Field desorption, FD)、場(chǎng)電離 (Field ionization, FI)和快原子轟擊 (Fastatom bombardment, FAB)技術(shù)。質(zhì)量分析器主要為磁場(chǎng)分析器 (sector)、四極桿濾波器 (quadrupole,Q)和離子回旋共振(ion cyclotron resonance, ICR )分析器。 ? 近十幾年出現(xiàn)了電噴霧電離 (Electrospray ionization, ESI)技術(shù)、基質(zhì)輔助激光解吸電離 (Matrixassisted laser desorption/ionization, MALDI)技術(shù)和表面增強(qiáng)激光解吸電離 (Surfaceenhanced laser desorption/ionization, SELDI)技術(shù)等 .質(zhì)量分析器為磁場(chǎng)分析器 (sector)、 四極桿濾波器 (quadrupole,Q)、離子阱分析器 (Ion trap)、離子回旋共振 (ion cyclotron resonance, ICR )分析器和飛行時(shí)間分析器 (Timeofflight, ToF)。 主要質(zhì)譜儀 目前商業(yè)化的生物質(zhì)譜儀，其離子化方式主要是 電噴霧電離 與 基質(zhì)輔助激光解吸電離 ，前者常采用 四極桿質(zhì)量飛行器 ，所構(gòu)成的儀器稱為電噴霧(四極桿 )質(zhì)譜儀，后者常采用 飛行時(shí)間質(zhì)量分析器 ，所構(gòu)成的儀器稱為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀。電噴霧質(zhì)譜的特點(diǎn)之一是 可以和液相色譜、毛細(xì)管電泳等高效分離手段聯(lián)用 ，因而可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜化合物分離與鑒定的聯(lián)機(jī)操作。而 MALDITOF質(zhì)譜儀的特點(diǎn)是對(duì) 鹽和填加物的耐受能力強(qiáng) ，且操作簡(jiǎn)便，測(cè)定速度快，易于實(shí)現(xiàn)高通量，譜峰與樣品成分的質(zhì)量有一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，圖譜容易解析。此外，用于生物大分子測(cè)定的質(zhì)譜儀還有離子阱 (ion trap)質(zhì)譜儀和傅立葉變換離子回旋共振 (fourier transform ion cyclotron resonance， FTICR)質(zhì)譜等。 ? 最近幾年出現(xiàn)的新型生物質(zhì)譜儀是在上述質(zhì)譜儀的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)與重新組合，主要有 電噴霧 — 四極桿 — 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 與帶有 串聯(lián)質(zhì)譜功能的 MAIDITOF質(zhì)譜儀 。前者在傳統(tǒng)的三級(jí)四極串聯(lián)質(zhì)譜儀的基礎(chǔ)上，采用飛行時(shí)間質(zhì)量分析器代替四極桿質(zhì)量飛行器，大大提高了儀器的分辨率和靈敏度。商品化的儀器有 QTOF(英國(guó) Micromass公司 )和 QSTAR(美國(guó) ABI公司 )等；后者是在質(zhì)譜中加入 源后裂解 (post souce decay， PSD)裝置或碰撞誘導(dǎo)解離 (collisionally induced dissociation， CID)裝置 ，從而使 MALDITOFMS測(cè)定 多肽序列成為可能 ，商品化的儀器有 Reflex III(德國(guó)Bluker公司 )和 Voy— ager DE STR(美國(guó) ABI公司 )等。 2DE膠上蛋白質(zhì)識(shí)別與鑒定流程圖 2DE膠上蛋白質(zhì)識(shí)別與鑒定技術(shù) 鑒定策略 對(duì)二維凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行切割，蛋白酶切，提取多肽混合物，采用 MALDITOFMS首先進(jìn)行肽質(zhì)量指紋譜分析，約 50％一 60％ 的蛋白質(zhì)在這一步可以得到鑒定，接著采用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行肽序列標(biāo)簽測(cè)定 (peptide sequence tag， PST)，約 20％～ 30％ 的蛋白質(zhì)可以得到鑒定。通過上述兩步質(zhì)譜分析，仍無法得到鑒定的蛋白質(zhì)，有可能是新蛋白質(zhì)，需要到核酸數(shù)據(jù)庫中作進(jìn)一步檢索，或者分離、制備一定量，采用全序列測(cè)定的方法進(jìn)行鑒定。 實(shí)驗(yàn)方法 完整蛋白質(zhì)（如凝膠分離或色譜純化蛋白質(zhì)） 肽混合物 質(zhì)譜測(cè)定肽質(zhì)量 （ MALDIMS,ESIMS) 選擇肽段裂解 PSDMALDIMS,ESIMS/MS) 計(jì)算方法 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫（＋核酸序列翻譯數(shù)據(jù)庫） 肽質(zhì)量檢索 未解析碎片離子檢索 酶切 質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的策略 ? 蛋白質(zhì)組學(xué)研究被用來評(píng)估代謝工程對(duì) TCE降解的影響， 2DE來檢測(cè)表達(dá)甲苯單加氧酶（將 TCE轉(zhuǎn)化成活性TEC環(huán)加氧酶）的大腸桿菌的蛋白組變化， 8種新蛋白在該菌株細(xì)胞中被鑒定，還有有 12種在宿主菌株中檢測(cè)不到的蛋白。將表達(dá)單加氧酶細(xì)胞曝露于 TCE中導(dǎo)致合成一種新蛋白而丟失 10種蛋白。因此，通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明代謝工程對(duì)菌株的生理有實(shí)質(zhì)的、復(fù)雜的影響。
高考資料相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1