現(xiàn)代分子生物學第二章-資料下載頁
2025-01-06 15:23本頁面
【正文】 。 DNA濃度越大，復性越快。 應(yīng)用 : ? PCR: 引物與模板 DNA的結(jié)合 ? Southern 和 Northern 雜交、 DNA芯片 第八節(jié) 研究核酸的常用方法 一、核酸的分離純化 DNA分離純化 ? 真核 DNA以核蛋白 （ DNP） 形式存在 ， DNP溶于水或高鹽溶液 （ 1mol/L NaCl） ， 但不溶于低鹽溶液 （ ） ， 據(jù)此 ， 采用高鹽提取 ， 低鹽沉淀 ， 可將 DNP與 RNA核蛋白分開 ， 提取出 DNP。 ? DNP可用 苯酚 抽提 ， 還可用 氯仿 /異戊醇 去除蛋白質(zhì) 。 ? 水相中的 DNA可被 NaAC乙醇沉淀 RNA的制備 （ 1） RNase 的滅活： ? 玻璃器皿：高溫焙烤 ? 塑料器皿： % DEPC， 37℃ ， 過夜 ? 提取液加鹽酸胍或異硫氰酸胍 ? 反應(yīng)體系中加特異的 RNase抑制劑 （ 2） 常用方法： ? 異硫氰酸胍 /苯酚 /氯仿法 ? 異硫氰酸胍 /氯化銫密度梯度離心法 蛋白質(zhì)：＜ ； DNA： ； RNA：＞ mRNA的制備： oligo(dT)纖維素親合層析法 質(zhì)粒 DNA的提取 堿裂解法（ alkaline lysis） 原理： 根據(jù)環(huán)狀質(zhì)粒 DNA與染色體 DNA的拓撲學差異 ? pH值 =~ ：染色體 DNA變性雙鏈解開，質(zhì)粒 DNA的雙鏈仍緊密結(jié)合 ? pH值 =中性 （ 加入 ） ：質(zhì)粒DNA準確復性 ， 染色體 DNA纏繞成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) ，通過離心與 RNA、 變性蛋白質(zhì)一起沉淀 ， 被除去 。 菌細胞 1. 懸浮細胞 2. 溶菌酶處理 3. SDS/NaOH 4. 醋酸鉀中和 培養(yǎng)液離心 質(zhì)粒、 RNA、蛋白質(zhì) (部分 ) 蛋白質(zhì)、細菌染色體 DNA、膜 接種、過夜培養(yǎng) （ 35mL） 水相（質(zhì)粒、 RNA） 變性蛋白質(zhì) 苯酚 氯仿 水相 Rnase A 二倍體積乙醇 質(zhì)粒 DNA TE溶解 蛋白質(zhì) 染色體 /線形 DNA 超螺旋質(zhì)粒 CsCl+EB 二、核酸的超速離心 測定核酸的浮力密度 測定 DNA中 GC的含量 GC含量與 DNA的浮力密度之間呈正比關(guān)系 溶液中核酸構(gòu)象的研究 用于核酸的制備 三、核酸的凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳 （ 1）原理：電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng) （ 2） DNA移動方向：負極 到正極 （ 3）影響遷移率的因素： ① 核酸分子的大小 ② 凝膠濃度 ③ DNA的構(gòu)象 : 超螺旋 ＞線形 ＞ 帶缺刻的 環(huán)形 ④ 電壓，不大于 5V/cm （ 4）染色：溴化乙錠 EB （ ） EB與 DNA結(jié)合后，經(jīng)紫外光的照射，可發(fā)出橙紅色的熒光 （ 5）操作過程： a、制備瓊脂糖凝膠（ 1 TAE緩沖液） b、膠板的制備 c、加樣 上樣緩沖液 （含溴酚藍） d、電泳 5V/cm e、染色 (溴化乙錠 ) f、觀察 (紫外燈 ) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? 可用于分析和制備小于 1Kb長度的 DNA片段 ? 多用垂直平板電泳 ? 分辨率高，可將僅相差 1 bp的 DNA分開 ? 制備和操作比瓊脂糖凝膠困難 四、核酸的分子雜交 （一）原理： 復性 探針： 一小段用同位素、生物素或熒光染料標記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在 （二）方法 Southern 印跡（ Southern Blotting） （ 1） 用途： 檢測 DNA （ 2）基本步驟： DNA樣品 → 酶切 → 電泳 → 堿變性 → 轉(zhuǎn)膜 → 固定 → 雜交 → 洗滌 → 放射自顯影 Southern 印跡 實驗 ① ② ③ 放射自顯影照片 （ 2） Northern 印跡 （ Northern blotting） 基本過程： RNA的提??； RNA變性電泳； RNA轉(zhuǎn)膜和固定； 雜交； 檢測 。 Westernblot法 1）總蛋白質(zhì)的提取 2） SDSPAGE分離蛋白質(zhì)分子 3）轉(zhuǎn)膜 4）雜交（一抗、酶標二抗） 5）顯色 Key points: ? 二級結(jié)構(gòu)多樣性 ? 超螺旋結(jié)構(gòu) ? 真核生物的染色體及其組裝 ? 核酸的性質(zhì) ? 研究核酸的常用方法 Question 一、作業(yè)題： 名詞解釋： 染色體、染色質(zhì)、常染色質(zhì)、異染色質(zhì)、組成性異染色質(zhì)、功能性異染色質(zhì)、超螺旋、正超螺旋、負超螺旋、拓撲異構(gòu)酶、拓撲異構(gòu)體、核小體、端粒、 ZDNA、核酸的變性、復性 二、思考題： 區(qū)分概念： 常染色體與常染色質(zhì)；核酸的變性與降解 。 蛋白質(zhì)變性與核酸變性 利用核酸的電負性、浮力密度、紫外吸收、變性和復性的性質(zhì)，可以做哪些分子生物學實驗？ 試從 DNA和 RNA結(jié)構(gòu)的不同解釋為什么 DNA被廣泛作為遺傳信息的承載者？ RNA在細胞內(nèi)行使哪些功能？
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