【正文】 A是主要結(jié)構(gòu)蛋白，存在于病毒囊膜內(nèi)側(cè)。 PB1， PB2和 PA是病毒復(fù)制酶的三個(gè)主要組分。 NS1和 NS2為非結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒復(fù)制早期起作用， NS1調(diào)節(jié)病毒 RNA的合成、 PremRNA的運(yùn)輸、剪切及 mRNA的翻譯過程。 NS2蛋白與 M1蛋白相互作用 ,參與病毒復(fù)制周期的調(diào)控。 圖 9－ 27 流感病毒 A株進(jìn)入宿主細(xì)胞及其復(fù)制過程圖示 9． 4． 3 禽流感病毒感染人類的機(jī)制 禽流感導(dǎo)致人類流感，目前主要有豬作為中間宿主的混合器假說和禽流感病毒直接感染人（即人本身充當(dāng)混合器）兩種假說。 禽流感病毒跨越種屬間的屏障從家禽直接感染人與其基因組的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。該病毒基因組為分多個(gè)片段，極易發(fā)生基因交換、重組和變異，導(dǎo)致感染宿主和致病性改變。 HA受體結(jié)合位點(diǎn)突變導(dǎo)致禽流感病毒感染人類細(xì)胞 HA是流感病毒表面主要糖蛋白，在感染過程中起關(guān)鍵作用。 HA結(jié)合受體位點(diǎn)的第 226位氨基酸與禽流感病毒的宿主細(xì)胞結(jié)合能力有關(guān)。 若該位點(diǎn)氨基酸殘基為谷氨酰胺，表現(xiàn)為SAa22,3 Gal受體（禽類呼吸道上皮細(xì)胞表面受體）結(jié)合特性； 若該位點(diǎn)為亮氨酸，則表現(xiàn)為 SAa22,6 Gal受體（人呼吸道上皮細(xì)胞表面受體）結(jié)合特性； 若該位點(diǎn)為甲硫氨酸，對(duì) SAa22,3 Gal和SAa22,6 Gal具有相同的結(jié)合能力。 1997年香港禽流感 H5N1病毒就是因?yàn)榈?226位氨基酸由谷氨酰胺突變?yōu)榧琢虬彼?，?dǎo)致禽流感病毒直接感染人細(xì)胞。 對(duì) H5及 H7亞型高致病力毒株序列分析表明，高致病力毒株的 HA在裂解位點(diǎn)附近有多個(gè)堿性氨基酸殘基，易被宿主蛋白酶系統(tǒng)裂解為HA1和 HA2，致病性增強(qiáng)。 PB2蛋白 627位點(diǎn)突變導(dǎo)致人禽流感病毒復(fù)制能力增強(qiáng) 禽流感病毒能否在人體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行有效復(fù)制，主要與病毒復(fù)制酶 (PB PB2和 PA)基因有關(guān)。 當(dāng) PB2蛋白基因來源于人流感病毒，無論其他基因片段來源于禽流感或人流感病毒，重組病毒在哺乳動(dòng)物體細(xì)胞中都能有效復(fù)制； 當(dāng) PB2蛋白基因來源于 AIV時(shí)，重組病毒不能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行有效復(fù)制。 禽流感病毒株 PB2第 627位氨基酸都是谷氨酸，而人流感病毒該位點(diǎn)上是賴氨酸。 香港 H5N1毒株中 PB2的第 627位就由谷氨酸突變成賴氨酸。所以， PB2第 627位氨基酸可能是決定 A型流感病毒宿主范圍的關(guān)鍵位點(diǎn)。 NS1第 92位氨基酸突變導(dǎo)致人禽流感病毒致病能力增強(qiáng) 普通流感病毒感染時(shí)，非結(jié)構(gòu)蛋白 (NS1)產(chǎn)生于機(jī)體受感染的細(xì)胞，與病毒復(fù)制產(chǎn)生的雙鏈RNA相互作用，產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)作用于 RNA病毒蛋白激酶 (PKR)以及核因子 NF2KB，干擾素等細(xì)胞因子被合成并發(fā)揮非特異性免疫作用。 高致病性人禽流感 H5N1亞型病毒感染者體內(nèi)雖然存在高濃度的干擾素和腫瘤壞死因子 2α，卻不能殺死病毒，因?yàn)檫@類病毒對(duì)細(xì)胞因子具有抵抗力。 H5N1亞型病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因（ NS1第 92位氨基酸）發(fā)生變異可能是產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因。 目前尚不清楚非結(jié)構(gòu)蛋白變異后，病毒通過何種信號(hào)途徑逃避細(xì)胞因子抗病毒作用。 9. 5 嚴(yán)重急性呼吸綜合癥的分子機(jī)制 9. 5. 1 嚴(yán)重急性呼吸綜合癥冠狀病毒的結(jié)構(gòu)與分類 Severe acute respiratory syndrome coronavirus， SARSCoV，冠狀病毒科冠狀病毒屬。病毒顆粒直徑在 80160nm，有囊膜，表面鑲嵌有 1224nm的球形梨狀或花瓣?duì)罾w突，由于囊膜上的纖突呈規(guī)則狀排列成皇冠狀，故稱之為冠狀病毒。 ， 圖 928 冠狀病毒顆粒結(jié)構(gòu)示意圖 病毒顆粒的囊膜由兩層脂質(zhì)組成，在兩層脂質(zhì)中鑲嵌有兩種糖蛋白，纖突蛋白 S（又稱 E2）和血凝素酯酶 HE（ hemagglutinin esterase，又稱 E3），膜蛋白 M（又稱 E1）和小包膜糖蛋白 E（ envelope protein）。 病毒粒子內(nèi)部為核衣殼蛋白 N和核基因組 RNA組成的核蛋白核心。 圖 929 SARSCoV病毒與其它冠狀病毒的系統(tǒng)進(jìn)化分析 已知冠狀病毒分為 3組，第 1和第 2組為哺乳動(dòng)物病毒，第 3組是禽類病毒。序列分析表明，SARSCoV的基因組序列與其它三組都存在很大差異，很難被歸入某一組。 SARSCoV最可能來源于動(dòng)物，特別是野生動(dòng)物如果子貍、蝙蝠、猴、蛇等。 有學(xué)者認(rèn)為它可能是第 2組的重組病毒，也有人認(rèn)為它可能是新的第 4 組冠狀病毒的代表。 9. 5. 2 SARSCoV的基因組結(jié)構(gòu) 是目前已知最大的 RNA病毒，基因組為單鏈正鏈 RNA，全長(zhǎng) 2730 kb， 5’端有甲基化帽子，前 2/3區(qū)域編碼病毒 RNA聚合酶復(fù)合蛋白，后1/3編碼 S、 E、 M和 N蛋白，在 S和 E之間、 M和 N之間以及 N蛋白基因的下游有未知功能的開放讀碼框，其 3’端有不少于 50個(gè)堿基的polyA。 其結(jié)構(gòu)蛋白 mRNA不存在轉(zhuǎn)錄后修飾、剪切等過程，而是通過 RNA聚合酶和某些轉(zhuǎn)錄因子以不連續(xù)轉(zhuǎn)錄機(jī)制，通過識(shí)別特定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列有選擇地從反義鏈 RNA上一次性轉(zhuǎn)錄得到完整的 mRNA。 SARSCoV全基因組共有 14個(gè)開放讀碼框，包膜上有 S、 M和 HE三種主要糖蛋白。 S蛋白可能是病毒誘發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體和細(xì)胞毒性 T細(xì)胞的主要抗原蛋白，參與 SARSCoV侵入宿住細(xì)胞的過程。 S蛋白又分為 S1和 S2兩部分， S1蛋白主要與宿主細(xì)胞膜受體結(jié)合， S2蛋白介導(dǎo)病毒囊膜和宿主細(xì)胞膜融合。 9. 5. 3 SARSCoV的侵染過程 SARSCoV的生活周期包括病毒侵染、復(fù)制和組裝及分泌幾個(gè)階段。侵染靶細(xì)胞時(shí)，病毒首先通過病毒囊膜上的 S蛋白與敏感細(xì)胞的受體結(jié)合，通過其編碼蛋白的自身折疊與相互結(jié)合牽引將病毒囊膜和細(xì)胞膜拉近而發(fā)生融合，使病毒遺傳物質(zhì)以內(nèi)吞作用方式進(jìn)入靶細(xì)胞細(xì)。 ACE2(血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 Ⅱ )是 SARS冠狀病毒的一個(gè)主要受體。 ACE2為依賴于鋅離子的金屬肽酶，是唯一已知在血壓調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ ACE）的同系酶，是 SARS病毒進(jìn)入細(xì)胞的主要靶點(diǎn)，也是對(duì) SARS進(jìn)行藥理干預(yù)的首選目標(biāo)。 SARS 冠狀病毒 S蛋白的 S1亞單位既具有與靶細(xì)胞受體結(jié)合的功能，又具有中和抗原表位。所以，針對(duì) S1亞單位的特異性抗體能夠中和SARS冠狀病毒感染。 圖 930 冠狀病毒的生活周期圖示 SARSCoV病毒的囊膜蛋白在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)翻譯，同時(shí)發(fā)生 N糖基化，并在粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面聚合形成非共價(jià)同源三聚體，運(yùn)輸?shù)礁郀柣鶑?fù)合體中進(jìn)行高甘露糖低聚糖基化修飾和酯?；?。 同時(shí)，病毒基因組復(fù)制，子代基因組 RNA通過基因組中的包裝信號(hào)與新合成的 N蛋白結(jié)合，形成螺旋狀的核衣殼之后再通過 M蛋白的作用與囊膜結(jié)組裝出芽。在病毒粒子的出芽的過程中， M、 S、 E蛋白嵌入到病毒粒子的囊膜中，形成的子代病毒粒子經(jīng)細(xì)胞膜融合而釋放到細(xì)胞外完成其生命周期 。 9. 6 基因治療 人類疾病的發(fā)生 ， 其實(shí)都是人體細(xì)胞中自身基因的改變或由外源病原體基因產(chǎn)物與人體基因相互作用的結(jié)果 。 9. 6. 1 基因治療的歷史沿革 1990年 ， 第一次用反轉(zhuǎn)錄病毒載體把 腺苷脫氨酶基因 （ ADA） 導(dǎo)入來自病人自身的 T淋巴細(xì)胞 ， 擴(kuò)增后輸回患者體內(nèi) 。 5年后 ， 患者體內(nèi)10%的造血細(xì)胞呈 ADA基因陽性 。 基因治療的兩大途徑 ex vivo與 in vivo方式 。 ex vivo途徑 將含外源基因的載體在體外導(dǎo)入人體自身或異體 （ 異種 ） 被 “ 基因工程化的 ” 細(xì)胞 ， 經(jīng)體外細(xì)胞擴(kuò)增后輸回人體 。 這種方法易于操作 ， 而且因?yàn)榧?xì)胞擴(kuò)增過程中對(duì)外源添加物質(zhì)的大量稀釋 ， 不容易產(chǎn)生副作用 。 同時(shí) ， 治療中用的是人體細(xì)胞 ， 尤其是自體細(xì)胞 ， 安全性好 。 in vivo途徑 將外源基因裝配于特定的真核細(xì)胞表達(dá)載體上 ，直接導(dǎo)入人體內(nèi) 。 用病毒型或非病毒型 ， 甚至裸 DNA為載體 ， 有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn) 。 治療基因以及其載體必須證明其安全性 ， 而且導(dǎo)入體內(nèi)之后必須能進(jìn)入靶細(xì)胞 ， 有效地表達(dá)并達(dá)到治療目的 。 9. 6. 2 基因治療中的病毒載體 用于基因治療的 病毒載體 應(yīng)具備以下基本條件： 攜帶外源基因并能裝配成病毒顆粒； 介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移和表達(dá)； 對(duì)機(jī)體沒有致病力 。 病毒載體的產(chǎn)生 將適當(dāng)長(zhǎng)度的外源 DNA插入病毒基因組的非必需區(qū) ， 包裝成重組病毒顆粒 。 將基因表達(dá)盒插入 HSV1病毒的 UL44（ 編碼糖蛋白 C） 基因的 Xba I位點(diǎn)中 ， 構(gòu)建成重組HSV病毒 。 由于 UL44基因?qū)?HSV病毒感染非必需 ， 該重組病毒可以在細(xì)胞中增殖傳代 。 重組型病毒載體 在不改變病毒復(fù)制和包裝所需的順式作用元件的情況下 ， 選擇性刪除病毒的某些必需基因尤其是前早期或早期基因 ， 所缺失的必需基因由同時(shí)導(dǎo)入細(xì)胞中的外源基因表達(dá)單位提供 。 一般通過同源重組方法將目的基因插入到病毒基因組中 。 無病毒基因的病毒載體 在輔助系統(tǒng)的作用下 ， 重組載體以特定形式（ 單鏈或雙鏈 DNA或 RNA） 被包裝到不含有任何病毒基因的病毒顆粒中 。 優(yōu)點(diǎn)是載體病毒安全性好 ， 容量大 。 缺點(diǎn)在于往往需要輔助病毒參與載體 DNA的包裝 ， 造成終產(chǎn)品中輔助病毒污染 。 基因治療中的問題 基因?qū)胂到y(tǒng) 基因表達(dá)的可控性 需要更多的治療基因 1） 基因?qū)胂到y(tǒng) 。 基因治療的關(guān)鍵是將治療基因送入特定靶細(xì)胞 ， 并得到高效表達(dá) 。 如果不能有效地將治療基因?qū)氪蠖鄶?shù)腫瘤細(xì)胞 ，至少要求它盡可能少地進(jìn)入正常細(xì)胞 。 2） 外源基因表達(dá)的可控性 。 最理想的可控性是模擬人體內(nèi)基因本身的調(diào)控形式 ， 需要全基因或包括上下游的調(diào)控區(qū)及內(nèi)含子序列 ， 將對(duì)導(dǎo)入基因的載體系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)峻的挑戰(zhàn) ， 因?yàn)榻窈蟮妮d體須有幾十 kb甚至上百 kb的包裝能力 。 在目的基因上游區(qū)接上 gal 4的順式元件 ， 用帶有皰疹病毒 VP16/gal 4 DNA結(jié)合區(qū)的孕酮受體的變異體作為激活蛋白 。 圖 931 導(dǎo)入基因的表達(dá)誘導(dǎo)框架。 該變異體 （ PRLBD△ ） 只能與孕酮的頡抗劑 （ RU486） 相結(jié)合而不與孕酮或其他衍生物結(jié)合 。 體系中沒有 RU486， 治療基因表達(dá)水平極低；加入 RU486后與 PRLBD△ 結(jié)合 ， 激活 VP16，形成雜合二體并通過 gal4與治療基因上游順式元件結(jié)合 ， 啟動(dòng)治療基因表達(dá) 。