【文章內(nèi)容簡介】 ↓ 篩選重組子 鏈分離 限制酶切 ↓ 模板增殖與純化 ↓ ↓ 純化標(biāo)記的 ssDNA 與引物退火 ↓ ↓ 定序反應(yīng) 定序反應(yīng) ↓ 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ↓ 真空干燥 ↓ 放射自顯影 ↓ 閱讀序列和計算機錄入 ↓ 核苷酸序列的分析與比較 Sanger雙脫氧核苷酸鏈終止法雙脫氧核苷酸鏈終止法 （ 1）原理： 雙脫氧（ 2′， 3′） 核苷酸可以象 2′脫氧核苷酸那樣直接摻入新合成的 DNA鏈中，但因 3′ 端不具 OH基，DNA鏈合成至此終止。由于雙脫氧核苷酸在每個 DNA分子中摻入的位置不同，故可根據(jù)不同長度的 DNA片段測定出核苷酸序列。dsDNA變性 → 與 1條標(biāo)記引物退火 → 在 4個反應(yīng)管中分別加入dNTP和 1種雙脫氧核苷酸 →DNA 聚合反應(yīng) → 反應(yīng)產(chǎn)物變性電泳→ 凝膠干燥 → 放射自顯影 → 序列讀取。（ 2）步驟雙脫氧核苷酸鏈終止法測序示意圖216。 雙脫氧核苷酸鏈終止法測序 (Sanger法 )原理DNA sequencing gel showing the separation of fragments in the four sequencing reactions (one per lane). 216。序列讀取方法1） 每一條帶都代表一條以雙脫氧核苷酸結(jié)尾的單鏈核苷酸片段。2） 從凝膠的正極往負(fù)極端直接讀取的序列，為從的新合成的單鏈序列 。 而從負(fù)極往正極直接讀取的序列，則為上述序列的反向序列 ( 方向為 )。模板序列則為上述序列的互補序列。 思考題： 假定某一 基因 克隆的部分序列為 5ˊ —TCACGTAAGT—3 ˊ ，試根據(jù) Sanger序列分析方法原理 畫出測定上述序列的放射自顯影示意圖，并對示意圖作必要的標(biāo)注和解釋。 DNA序列測定的自動化 使用自動測序儀 ,使得模板制備自動化、定序反應(yīng)自動化、凝膠電泳自動化、核苷酸序列閱讀與計算機輸入自動化。 DNA序列分析自動化包括兩個方面的內(nèi)容 :一是指 “ 分析反應(yīng) ” 的自動化 。另一方面則是指 “ 讀片過程 ” 的自動化。優(yōu)點： i. 四個反應(yīng)系統(tǒng)可合并點樣，大大節(jié)省制膠和 點樣時間。 列，不需干燥凝膠和放射自顯影。 ，可讀出較多的核苷酸序列。缺點： 無法保留原始記錄 , 四個反應(yīng)產(chǎn)物點在一條道上 ,相互間會發(fā)生干擾 , 導(dǎo)致讀序時分辨率下降。216。 DNA序列測定的自動化216。 熒光素標(biāo)記核苷酸 — 應(yīng)用舉例In DNA sequencing using dideoxynucleotides labeled with fluorescent dyes, all four ddNTPs are added to the same tube, and during primer extension, all binations of chains are produced.Automated DNA sequencing using fluorescent dyes, one for each base 基因文庫的建立216。 克?。?clone）： 作名詞用，是指具有相同 DNA分子的一個群體或基因型相同的一個生物群體。作動詞用，指 “ 進行克隆 ” 或 “ 去克隆 ” ，將一特定 DNA順序插入一個載體分子。216。 亞克?。ù慰寺?，二級克隆， subclone）： 是指從已經(jīng)克隆在載體中的一個大片段中取出較小的 DNA片段再進行克隆的方法。 216。 基因文庫 (gene library):包括基因組文庫和 cDNA文庫。? YAC和 BAC文庫216。 基因工程基本操作步驟： “分、切、連、轉(zhuǎn)、篩 ”基因組文庫的構(gòu)建步驟 基因組文庫216。 基因組文庫 : 含有某種生物全部遺傳信息的重組 DNA分子的克隆總體。216。 基因組文庫的規(guī)模 ： N = ln（ 1–p ） /ln（ 1f） 上式中， N：克隆數(shù)； p：某 DNA片段在基因文庫中出現(xiàn)的概率； f：插入片段的平均大小與基因組大小的比值。 cDNA文庫 從一定生長階段的某種細(xì)胞或組織分離得到的總 mRNA反轉(zhuǎn)錄成總 cDNA，插入到克隆載體，然后再將 cDNA重組子轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中進行增殖。通過上述方法所獲得的無性繁殖系即為 cDNA文庫。cDNA文庫構(gòu)建步驟216。 與 cDNA克隆或文庫構(gòu)建有關(guān)的幾個問題 l cDNA的概念： 第一鏈 cDNA； cDNA基因； cDNA編碼序列。l mRNA質(zhì)量的檢測： 根據(jù) 甲醛變性膠電泳 的 rRNA的帶型進行判定。l mRNA的純化 ： 0ligo（ dT） 纖維素柱層析；抗生物素蛋白 磁珠吸附法 。 [生物素標(biāo)記 0ligo（ dT） ]。l cDNA重組子的形成 ： 在 cDNA雙鏈末端或添加同聚物單鏈尾巴，或添加含適當(dāng)限制酶識別序列的 “接頭 ” （ linker），以便與適當(dāng)載體重組。Trametes gallica總 RNA的甲醛變性電泳mRNA質(zhì)量的檢測mRNA的純化Promega Poly（（ AT）） tract mRNA Isolation System分分離離 Poly(A)RNA：： 將將 用生物素標(biāo)記的 Oligo（（ dT)與總與總 RNA共溫育共溫育；加入包被有抗生物；加入包被有抗生物素蛋白的微磁球；用素蛋白的微磁球；用磁場吸附磁場吸附 Oligo(dT)mRNA。cDNA文庫構(gòu)建圖解 分子標(biāo)記技術(shù)216。 遺傳標(biāo)記 : 是基因型的特殊的易于識別的表現(xiàn)形式，它是生物分類學(xué)、遺傳學(xué)、育種學(xué)、物種起源與進化等研究的主要技術(shù)指標(biāo)之一。包括形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記和分子標(biāo)記等。216。 分子標(biāo)記 : 分子標(biāo)記指能反映生物個體或種群之間基因組 DNA差異的 DNA序列 。分子標(biāo)記廣泛存在于基因組的各個區(qū)域，數(shù)量大，多態(tài)性高。分子標(biāo)記大多以