【文章內(nèi)容簡介】 泛的應用。 研究現(xiàn)狀及進展 短鏈脂肪酸 是結腸腔內(nèi)重要的有機酸陰離子 ,通過離子或非離子形式被結腸粘膜吸收 ,是結腸和小腸上皮細胞的主要供能物質 .臨床研究表明 ,短鏈脂肪酸能較強地維護腸道形態(tài)及功能 ,并具有一定的治療作用 ,通過測定生物基質中短鏈脂肪酸的水平可以整體診斷體內(nèi)厭氧菌的變化 ,短鏈脂肪酸的含量也可以反映細菌活性 .因此 ,短鏈脂肪酸的測定對營養(yǎng)、微生物和環(huán)境的研究有重要的意義 . 短鏈脂肪酸含量的早期測定方法是滴定法 ， 隨著色譜技術的發(fā)展 ,氣相色譜 (GC)、高效液相色譜 (HPLC)以及毛細管電泳 (CE)已廣泛用于 SCFA 的測定 ， 但極性大、揮發(fā)性強和水溶性大的特點使短鏈脂肪酸難以定量 ,生物基質的復雜性也更增加了定量工作的北京工商大學畢業(yè)論文（設計） 7 難度 .目前 ,原子吸收分光光度法、反相高效液相色譜技術也使用較多 ,方法也比較成熟 。 氣相色譜也涉及到好多領域，比如藥分析，環(huán)境污染物分析，石油化工分析，食品分析等。 因此氣相色譜的研究和發(fā)展也不斷地進行中，自動化程度進一步提高，特別是 EPC（電子程序壓力流量控制系統(tǒng)）技術已作為基本配置在許多廠家的氣相色譜儀上安裝（如 HP6890， ShimadzuGC17AGC2022， Varian3800， PEAutoXL， CE Mega8000 等），從而為色譜條件的再現(xiàn)、優(yōu)化和自動化提供了更可靠更完善的支持。色譜儀器上的許多功能進一步得到開發(fā)和改進，如大體積進樣技術，液體樣品的進樣量可達 500 微升；檢測器也不斷改進，靈敏度進一步提高；與功能日益強大的工作站相配合，色譜采樣速率顯著提高，最高已達到 200 赫茲，這為快速色譜分析提供了保證。色譜工作站功能不斷增大，通訊方式緊跟時代步伐，已實現(xiàn)網(wǎng)絡化，從技術上講，現(xiàn)在實現(xiàn)氣相色譜儀的遠程操作（樣品已置于自動進樣器中）是沒有問題的 [13]。 北京工商大學畢業(yè)論文（設計） 8 第二章 材料與方法 實驗材料 實驗試劑和藥品 表 實驗試劑和藥品一覽表 試劑名稱 純度 來源 乙酸 色譜純 北京半夏科技 有限公司 丙酸 色譜純 北京半夏科技 有限公司 丁酸 色譜純 北京半夏科技 有限公司 乳酸 色譜純 北京半夏 科技有限公司 2甲基丁酸 色譜純 北京半夏科技有限公司 乙腈 色譜純 北京半夏科技有限公司 鹽酸 分析純 國藥集團化學試劑有限公司 氯化鈉 分析純 國藥集團化學試劑有限公司 磷酸 分析純 國藥集團化學試劑有限公司 偏磷酸 分析純 國藥集團化學試劑有限公司 乙醚 分析純 國藥集團化學試劑有限公司 實驗儀器和設備 表 實驗儀器和設備一覽表 儀器設備名稱 型號規(guī)格 來源 氣相色譜儀 CP3800 美國瓦里安 VARIAN公司 氣相色譜注射針 5微升 迪馬公司 離心機 實驗室儀器 北京工商大學畢業(yè)論文（設計） 9 攪拌機 H7SGJ101 實驗室儀器 電子天平 AY220型 實驗室儀器 實驗方法 標準液配制 標準液配制：量取乙、丙、丁酸的色譜純標準品，分別加入 10μL, 1mol/L 的內(nèi)標溶液（ 2甲基丁酸），以溶劑乙腈稀釋至 ，制成乙、丙、丁酸濃度分別為 ， ， ， 。 色譜條件的優(yōu)化 色譜條件是直接決定色譜圖質量的一個重要實驗條件。為了確定效果好的氣相色譜條件，我們用標準短鏈脂肪酸樣品測定對象，比較了 3 種色譜條件。 色譜條件 A：柱型號 Jamp。M1227032；柱規(guī)格為 250mm 的 DBWAX毛細管柱測定采用程序升溫，初溫 90℃ ，保持 1min；以 60℃ /min 速 度升至 170℃ ；然后以 15℃ /min 速度升至 250℃ ，柱溫度 90℃ ，分流比為 ； 1，載氣為氮氣，燃氣氫氣，流速為 ， FID檢測器溫度為 250℃ ，進樣口溫度為 200℃ ，進行時間 . 色譜條件 B：柱型號 Jamp。M1227032；柱規(guī)格為 250mm 的 DBWAX毛細管柱。測定采用程序升溫，初溫 100℃ ，保持 ；以 8℃ /min 速度升至 180℃ ，保持 1min；然后以 20℃ /min 速度升至 200℃ ，保持 5min，分流比為 10:1，載氣為 He，流速為 ， FID 檢測器溫度為 250℃ ，進樣口溫度為 250℃ 。 色譜條件 C：柱型號 Jamp。M1227032；柱規(guī)格為 250mm 的 DBWAX毛細管柱。柱子溫度 230℃ ，進樣口 溫度 230℃ ， 初溫 60℃ 保持 1min，以 6℃ /min 的速度升至 120℃ ，再以 20℃ /min 的速度升至 220℃ ，保持 5min。 北京工商大學畢業(yè)論文（設計） 10 樣品處理方法 色譜條件為上面所述色譜條件二（下同）。標準溶液的配制和測定跟上面所述保持一致。 第一個樣品處理方法：鹽酸水提法 。 準確稱取糞便樣品 于 10mL 離心管中；加入 4mL 稀釋液 (15mL100mmol/L2乙基丁酸和 50mL5mmol/L 的 HCl 混合而成 )；均質 1min；于 5000r/min 離心 20min；取 1mL上清液于安培瓶中，進行 GC 分析。根據(jù)標準曲線計算得出短鏈脂肪酸含量。 第二種樣品處理方法：偏磷酸處理法 。 準確稱取備用大鼠糞便 克溶于 7mL 離心試管中，加純水 ，漩渦混勻 5min，以轉速 15000r/m,4℃ ，離心 20min，取上清液于另一個離心管，加入體積分數(shù)為 25%的偏磷酸溶液 100mL，漩渦混勻 5min， 4℃ ，放置過夜，后再以轉 15000r/m,4℃ ，離心 20min，取上清液，再用 10μL 上清液，加 10μL 內(nèi)標配成 ，走氣相色譜。偏磷酸在本實驗中具有脫水濃縮樣品，沉淀糞便溶液中的蛋白質和磷酸化的作用。 第三個樣品處理方法： 水提 乙醚萃取法 。 準確稱取備用的大鼠糞便 ，加入 4mL 稀釋液 (15mL100mmol/L 的 2乙基丁酸和50mL5mmol/L 的 HCl 混合而成 )， 渦旋混勻， 4000r/min 離心 10min，取 1mL 上清液于EP 管中，用乙醚萃取 3 次，三次的乙醚倒在一起，加 10μL 內(nèi)標，加適量的無水硫酸鈉除水，把乙醚轉移到有塞子的小瓶子里，在通風處揮發(fā)到一定體積，蓋上蓋子放在 4℃冰箱待測，乙醚揮發(fā)速度很快，一定注意也要盡快測定。 第四種樣品處理方法：固相 微 萃取法 。 凍干的樣品稱重取 5mL水復溶攪勻 ,加入 5mol/L的鹽酸調節(jié)上清液 pH2~3,靜置 10min 后離心 ,取上清液，在 SPME 裝置上， 60℃ 條件下，萃取半個小時，把萃取針萃取的溶液進入氣相色譜系統(tǒng)檢測。 樣品的測定 實驗大鼠 分為對比組和實驗組，對比組包括正常大鼠 和模型（肥胖的）大鼠，實驗組包括高劑量，中劑量，低劑量灌胃原花青素的大鼠。 實驗樣品為取自上述三組大鼠兩北京工商大學畢業(yè)論文（設計） 11 周，四周，六周時間間隔后的糞便，放在零下 20℃冰箱里的備用品。樣品前處理之后，標號，走選擇好的氣相色譜程序，獲得各 樣品氣相色譜圖之后，根據(jù)各酸的標曲算出個樣品中四種短鏈脂肪酸的含量。根據(jù)數(shù)據(jù)分析實驗結果并總結。 北京工商大學畢業(yè)論文（設計） 12 第三章 結果與分析 氣相色譜條件優(yōu)化 采用乙酸標準品，研究 3 種色譜條件對乙酸氣相色譜分離效果，峰型的影響。 圖 采用色譜條件 A 的乙酸 GC 圖譜（ 3：內(nèi)標； 4：乙酸； 6：溶劑） 圖 色譜條件 B的乙酸 GC圖譜（ 1：內(nèi)標； 2：乙酸； 3：溶劑） 北京工商大學畢業(yè)論文（設計） 13 圖 采用色譜條件 A 的乙酸 GC 圖譜（ 1：內(nèi)標； 3：乙酸； 4：溶劑） 以乙酸標準樣品氣相色譜圖為例，比較三種色譜條件效果。色譜圖的質量可以從色譜圖基線平度，各峰相互分離的程度，雜峰數(shù)量等幾個方面可以確定。從乙酸三種色譜條件下的圖可以看出第一種和第三種方法，基線不平，各峰沒有完全分離開來，第二種色譜條件下出來的峰比較分散，可以更好的定性 和定量分析，所以可以確定最佳色譜條件為 色譜條件 B。 標曲制作 為了確定樣品中短鏈脂肪酸的含量，先用五個已知濃度梯度的短鏈脂肪酸標準溶液，作出一條標準曲線。以系列溶液中各酸的濃度（ mmoL/L）與內(nèi)標物濃度 mmoL/L）比為橫坐標 (x)，各酸組分與內(nèi)標物的峰面積比為縱坐標（ Y），建立標準曲線，進行回歸計算，得到線性回歸方程。 本實驗測得乙酸，丙酸，丁酸，乳酸的標準曲線如表 所示。 表 酸名酸名 保留時間（ min） 線性方程 R平方值 乙酸 Y=+ 丙酸 Y=+ 丁酸 Y=+ 乳酸 Y=+ 北京工商大學畢業(yè)論文（設計） 14 前處理方法的優(yōu)化 為了使樣品前處理方法具有可比較性，所有的樣品選擇 4 號樣品做測試對象。以下為 4 種方法的氣相色譜圖。 圖 鹽酸提水法 GC 色譜圖（ ） 圖 偏磷酸法 GC 色譜圖（ ； ； ； ； ） 北京工商大學畢業(yè)論文（設計） 15 圖 水提 乙醚萃取法 GC色譜圖（ 1：乳酸； 2：內(nèi)標； 3：丁酸； 4：丙酸； 6：乙酸； 7：乙醚） 圖 固相微萃取法 GC色譜圖（ ） 從色譜圖的角度分析，鹽酸水提法得到的樣品圖各峰沒有徹底分離開來，有峰連續(xù)的現(xiàn)象，基線不平的現(xiàn)象 。偏磷酸處理法，還存在一些明顯的雜峰還沒消除掉，但基線比鹽酸水提法 基線的平度 好， 可以提高分析結果的準確性。有機萃取法是短鏈脂肪酸提取中的有效方法，本實驗中經(jīng)過多次試驗之后， 水提 乙醚萃取法效果比其他方法好，各目標酸峰分離的比較好，雖然氣相色譜圖結果當中乙醚峰面積最大，但結合內(nèi)標峰面積可以比較準確的算出短鏈脂肪酸的含量。固相微萃取效果相對第一和第二種方法效果好，但還是存在雜峰比較多，效果不如 水提 乙醚萃取方法好。固相微萃取中萃取時間比較長，萃取溫度也比較高，因為糞便中各種物質種類比較多，在這種萃取條件下難以確定短鏈脂肪酸是否與糞便中的其他物質發(fā)生反應，這方面還需要進一步研究確。 北京工商大學畢業(yè)論文（設計） 16 大鼠糞便 SCFA 含量的測定 測定來自三組大鼠的 15 個糞便樣品，得到 SCFA 含量如圖 所示。 圖 SCFA濃度 從圖 可以看出 模型組的 SCFA 總含量少于其他兩個組，灌胃原花青素的實驗組SCFA 總含量比其他兩組高。低，中，高劑量組相互比較時， SCFA 隨著原花青素的劑量增加而增加，這說明原花青素對大鼠降脂有一定的促進作用。四種酸含量中乙酸和乳酸比較多，丁酸明顯少于其他 SCFA。 誤差分析 本次試驗存在一些造成誤差的因素，這些因素包括樣品的狀態(tài)，樣品處理過程中實驗者操作中產(chǎn)生的誤差，因為各種原因在色譜圖中產(chǎn)生的基線不平，雜峰多等幾個方面因素。 所謂基線不穩(wěn)定，也就是基線的噪音、漂移以及該檢測器的基流等超出了儀器所要求的最低指標。引起基線不穩(wěn)的因素很多，如外圍條件、工作站、電路、氣路都有可能。樣品太臟， 柱箱 或者檢查器溫度不穩(wěn)定， FID 氣體配比不合適導致火焰不穩(wěn)，柱填充物松動，柱中固定相流失等狀態(tài)都可能導致基線不平。 北京工商大學畢業(yè)論文（設計） 17 同理使保留時間改變的因素也很多 ，氣路泄露，進 樣不合適，進樣者進樣 操作不一致或不規(guī)范都可能導致保留時間不一樣。 樣品的狀態(tài)也是直接影響實驗結果質量的關鍵因素。實驗過程中多次重復融化樣品和凍結樣品，導致樣品質量變差。實驗 15 個樣品，數(shù)量比較 多，這個因素也可能導致往后測得樣品結果有所差別。這些造成實驗誤差的因素，都可以加以調整，從而減少或避免誤差的產(chǎn)生。 北京工商大學畢業(yè)論文（設計） 18 第四章 結論與建議 結論 過三組優(yōu)化實驗得到測定大鼠糞便中短鏈脂肪酸的最佳色譜條件 :色譜條件 B。色譜條件 B:柱型號 Jamp。M1227032；柱規(guī)格為 250mm m 的 DBWAX 毛細管柱。測定采用程序升溫，初溫 100℃ ，保持 ；以 8℃ /min 速度升至 180℃ ，保持1min；然后以 20℃ /min 速度升至 200℃ ，保持 5min，分流比為 10:1，載氣為 He，流速為 ， FID檢測器溫度為 250℃ ，進樣口溫度為 250℃ 。 :乙醚萃取法。 3 實驗結果為模型組的 SCFA 總含量少于其他兩個組，灌胃原花青素的實驗組 SCFA總含量比其他兩組高。低，中，高劑量組相互比較時， SCFA隨著原花青素的劑量增加而增加，這說明原花青素對大鼠降脂有一定的促進作用。 建議 本實驗的研究仍有許多工作有待進一步研究，本實驗沒有定量算出四種樣品前處理方法的 SCFA 提取率，只局限在從色譜圖的質量來分析，因此前處理方法的優(yōu)化過程還有進一 步細化的空間。 大鼠糞便中各種物質種類很多， SCFA 是否與其他物質發(fā)生反應，發(fā)生什么樣的反應還是一個值得進一步研究的內(nèi)容。 北京工商大學畢業(yè)論文（設計） 19 致謝 在本次論文設計過程中，感謝我的學校，給了我學習的