【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 根據(jù)樣品的具體 特點(diǎn)選擇合適的甲酯化方法。 分析大豆脂肪酸組分的方法，過(guò)去是首先常采用索氏抽提法或二氧化碳臨界 3 萃取法獲得脂肪 [11]，使用有機(jī)溶劑溶解脂肪，獲得待測(cè)樣品，再進(jìn)一步對(duì)樣品甲酯化，通過(guò) GC 分析得到脂肪酸組分的圖譜。此法花費(fèi)時(shí)間極長(zhǎng)，溶劑用量大，而且效率并不高，但檢測(cè)精確度高。而目前實(shí)驗(yàn)室中廣泛采用的是豆粉直接甲酯化法，即通過(guò)粉碎機(jī)將大豆籽粒磨成豆粉，然后加入萃取試劑，通過(guò)離心取上清液然后進(jìn)行甲酯化以及 GC 分析 [12]。豆粉直接甲酯化法適用于大量樣品的快速檢測(cè)，可以避免傳統(tǒng)方法長(zhǎng)時(shí)間的加熱對(duì)脂肪酸的組分產(chǎn)生影響， 而且此法精密度上與索氏抽提法沒(méi)有顯著差異，可以節(jié)約大量的時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)的效率。 氣相色譜（ gas chromatography，簡(jiǎn)稱 GC）技術(shù)的發(fā)展已有 50多年的歷史，它現(xiàn)在是一種相當(dāng)成熟的分離技術(shù)，因分析速度快、分離效率高、靈敏度高、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)被廣泛使用。從俄國(guó)植物學(xué)家茨維特（ ）在 1901年首先發(fā)現(xiàn)并命名色譜，到現(xiàn)在氣相色譜 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的成熟，氣相色譜在分析中逐漸確立了自己在歷史舞臺(tái)上的位置。 GC 是利用試樣中各組份在氣相和固定液液相間的分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離的。當(dāng)氣化后 的試樣被載氣帶入色譜柱中運(yùn)行時(shí)，組份就在其中的兩相間進(jìn)行反復(fù)多次分配。由于固定相對(duì)各組份的吸附或溶解能力不同，因此各組份在色譜柱中的運(yùn)行速度就不同，結(jié)果在載氣中分配濃度大的組分先流出色譜柱，而在固定相中分配濃度大的組分后流出。經(jīng)過(guò)一定的柱長(zhǎng)后，便彼此分離，按順序離開(kāi)色譜柱進(jìn)入檢測(cè)器，產(chǎn)生的離子流訊號(hào)經(jīng)放大后，在記錄器上描繪出各組份的色譜峰 [13]。 對(duì)相同的樣品，前期處理的試劑不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也會(huì)產(chǎn)生明顯的差異，采用正己烷進(jìn)行脂肪酸的溶解浸提，與采用苯：石油醚 =1： 1 的萃取液進(jìn)行萃取，效果明顯不同。采用苯：石 油醚 =1： 1 萃取液進(jìn)行 GC 分析后，脂肪酸的峰值會(huì)更高，峰也比較標(biāo)準(zhǔn)。前期處理后，將樣品進(jìn)行甲酯化，控制甲酯化的時(shí)間，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)，最終確定了實(shí)驗(yàn)的方案，為后續(xù)樣品的檢測(cè)分析提供了實(shí)驗(yàn)方法以及依據(jù)。 研究對(duì)大豆脂肪酸分析的前處理過(guò)過(guò)程進(jìn)行了條件優(yōu)化，以期為育種工作者進(jìn)行材料篩選提供簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。 4 1 材料與方法 實(shí)驗(yàn)材料 植物材料 大豆成熟籽粒，品種分別為二粒黑豆、高作選 1 號(hào)、灌云海白花、黃大粒、龍川黃牛毛、東農(nóng) 36 號(hào)、東山 6東山白馬豆、二季早豆 合 豐 24 號(hào)、花綠黃豆、花色豆、化眉豆、淮陽(yáng)春豆、黃豆、黃豆 合豐 3合龍油太、黑河一號(hào)、橫峰烏豆、花黑虎、黃稈豆、黃臍、回茬小黃豆、冀豆 7 號(hào)、犍為泉水豆、劍格化林雞窩豆、醬黃豆、金山茶禾未食豆、 821巴中田坎豆 ② 、白露豆、白毛豆、白毛早豆子、 77391大黑豆、大黑臍、大黃豆 大黃豆 大黃珠、大粒黑豆、大粒黃、大青仁、大天鵝蛋、大屯小黑豆、代米豆、丹徒小烏甲 主要儀器 萬(wàn)能粉碎機(jī) sp100， Agilient6890N 型氣相色譜儀， FFAP 彈性石英毛細(xì)管柱（ 50m ） 主要試劑 ： 脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品：軟脂酸 ( Palmitic acid 分析純＞ %) 、硬脂酸 ( Stearic acid 分析純＞ 99%) 、油酸 ( Oleic acid 分析純＞ 99%) 、亞油酸 ( Linoleic acid 分析純＞ %)、 亞麻酸 ( Linolenicacid 分析純＞ 99%) ，購(gòu)于美國(guó) SIGMA 公司； 正己烷 ( 色譜純＞ %) ；甲醇 ( 分析純＞ 99%) 、苯（分析純＞ 99%）、石油醚 ( 分析純＞ 99%)、氫氧化鈉（分析＞ 99%）。分別采用正己烷和苯：石油醚 =1： 1 對(duì) 5 種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行稀釋至 。 實(shí)驗(yàn)方法 甲酯化試劑的準(zhǔn)備 取分析純氫氧化鈉 放入帶磨口的棕色試劑瓶中，取 100ml 甲醇沿玻璃棒注入試劑瓶中，攪拌 3min，在室溫反應(yīng) 2h 后，待用， 4℃保存，可用 3d。 樣品前期處理 將樣品用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎后，稱取 豆粉樣品于 的離心管中，加入1ml 正己烷，充分振蕩 ，室溫放置 5h。 5 脂肪提取及甲酯化 檢測(cè)方法 ： 將供試材料用研磨儀充分研磨 ， 磨好后取 g 的豆粉放入 mL 離心管中 ， 加 1 mL 脂肪提取液 ， 振蕩混勻 10 min， 離心后取上清 ， 加 1 mol/L 甲醇鈉甲酯化 ， 靜置 10 min， 加飽和 NaCl 溶液至樣品分層。吸取 1 μL 上清液進(jìn)入氣相色譜。 色譜條件 為了獲得較好的分離效果、較高的靈敏度和理想的分辨率，分析前對(duì)不同的進(jìn)樣口壓力、載氣流速、程序升溫條件等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。最終確定了以下色譜條件。 色譜分析條件： 美國(guó)安捷倫公司 Agilent6890N 氣相色譜儀， FFAP 彈性石英毛細(xì)柱（ 30m320μm），進(jìn)樣口為 Agilent 分流 /不分流進(jìn)樣口，進(jìn)樣口溫度為 250℃ ， FID 檢測(cè)器溫度為 250℃ ，氮?dú)饬魉? 40ml/min，氫氣流速 40ml/min，空氣流速 450ml/min，分流比 20:1，樣品進(jìn)樣量 1μl，程序升溫：初始溫度 80℃ ，25℃ /min 到 200℃ ，再以 3℃ /min 到 215℃ ，最后以 2℃ /min 到 230℃ 。 2 結(jié)果與分析 不同萃取溶劑對(duì)脂肪酸提取效果比較 到目前為止，脂肪酸的提取大部分采用采用 Folch[14]法或 Bligh 和 Dyer[15]法這兩類比較經(jīng)典的提取方法。 Folch 法是用 CHC13/CH3OH（ 2:1）的溶劑先將脂類從動(dòng)植物組織中萃取出來(lái)，隨帶出的水形成一定組成的三元溶劑混合物。 CHCl3 相含脂類，水相含非脂溶性的物質(zhì)。這種方法幾乎可把所有的脂類包括結(jié)合態(tài)脂從組織中提取出來(lái)。但是 CHCl3 的毒性較大，還會(huì)引起一些副反應(yīng)，所以人們還發(fā)展了許多其它的溶劑萃取系統(tǒng)。 如韓菊 [16]等人和 等 [17]人用二氯甲烷代替三氯甲烷萃取類脂，結(jié)果基本一致，而 CH2Cl2 的毒性小得多，更安全可靠。常用的萃取溶劑還有苯，石油醚、正己烷、乙醚、正己烷 /異丙醇、正己烷：甲醇 (1:1， V/V)、乙醚乙醇 (1: 3， V/V)，苯：石油醚 (1:1， V/V)等。考慮到試劑的毒性問(wèn)題，本文采用了毒性相對(duì)較小的苯、石油醚和正己烷作溶劑，并對(duì)二者的提取效果進(jìn)行了比較。兩種方法的色譜 6 圖如圖 1 和圖 2 所示。 圖 1 苯和石油醚做萃取劑提取大豆脂肪酸的氣相色譜分析譜圖 圖 2 正己烷做萃取劑提取大豆脂肪酸的氣相色譜分析譜圖 結(jié)果顯示，由苯、石油醚以及正己烷做溶劑提取脂肪酸，二者提取結(jié)果相差不大，苯和石油醚的混合物效果略好。所以本實(shí)驗(yàn)對(duì) 50 個(gè)樣品進(jìn)行脂肪酸提取采用的是苯和石油醚作為脂肪酸的提取溶劑。 m in8 10 12 14 16 18 20 22 24pA2030405060708090100 F I D 1 A , ( 張學(xué)玲 1 3 0 5 0 6 \ 1 3 0 4 1 5 2 0 1 3 0 5 0 6 1 6 1 7 1 5 \ 0 2 6 F 0 6 0 1 . D ) 15.621 18.902 19.361 20.396 21.967m in8 10 12 14 16