【文章內(nèi)容簡介】 cAMP）的受體蛋白 （ 2） 下游部分 — RNApol的進(jìn)入（結(jié)合）位點 － 35 ~ － 10 包括識別位點和結(jié)合位點（ R B位點） RNA聚合酶的進(jìn)入位點 （ 1） Sextama 框（ Sextama Box） 167。 35序列， RNA聚合酶的松弛（ 初始 ）結(jié)合位點， 167。 RNA聚合酶依靠其 σ亞基識別該位點 — 識別位點（ R位點） 167。 大多數(shù)啟動子中共有序列為 T82T84G78A65C54A45 167。 重要性 :很大程度上決定了啟動子的強度 （ RNApol 的 σ因子） 167。 位置在不同啟動子中略有變動 （ 2） Pribonow 框（ Pribonow Box） 167。 10序列， RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點 結(jié)合位點（ B 位點） 167。 一致序列： T80A95T45A60A50T96 （ TATPUAT） 167。 位置范圍 － 4 到－ 13 因此又稱 TATA Box 保守 T 啟動子的研究： (RNA聚合酶保護法 ) 5? 5? RNA聚合酶保護區(qū) 結(jié)構(gòu)基因 保守序列 （ 一 致性序列） 開始轉(zhuǎn)錄 T T G A C A A A C T G T 35 區(qū) (Pribnow box) T A T A A T Pu A T A T T A Py 10 區(qū) 1 30 5 0 10 10 40 20 5 ? 3 ? 3 ? 5 ? RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合 （ 3） 起始位點（ initiation site）：＋ 1位點 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄起始位點 起始 NTP多為 ATP或 GTP (嘌呤 ) 起始 過程 ： a. 全酶與啟動子結(jié)合的封閉型啟動子復(fù)合物的形成 （ R位點被 σ因子發(fā)現(xiàn)并結(jié)合 ） b、 開放型啟動子復(fù)合物的形成 167。 RNApol的一個適合位點到達(dá)－ 10序列區(qū)域，誘導(dǎo)富 含 Pribnow 框的“熔解”， 形成 12－ 17bp的泡狀 物，同時酶分子向－ 10序列轉(zhuǎn)移并與之牢固結(jié)合 167。 開放型啟動子復(fù)合物使 RNApol聚合酶定向 167。 兩種復(fù)合物均為二元復(fù)合物（全酶和 DNA ） c. 在開放型的啟動子復(fù)合物中， RNApol的 I位點和 E位點的 核苷酸前體間形成第一個磷酸二酯鍵（ β 亞基） 三元復(fù)合物形成 +1位多為 CAT模式 ,位于離開保守 T 6~9 個核苷酸處 69 bp G C T A TTGACA TATAAT 1618 bp +1 35 sequence 10 sequence （ 4） σ因子解離 → 核心酶與 DNA的親和力下降 起始過程結(jié)束 → 核心酶移動進(jìn)入延伸過程 轉(zhuǎn)錄的起始過程 σ 核心酶 12～ 17bp （ β亞基） CAPcAMP 結(jié)合位點 （也稱 CAP位點） 轉(zhuǎn)錄調(diào)控中， I → 阻遏蛋白 → 負(fù)調(diào)控 lac 操縱子模型 I 許多基因的表達(dá)還存在正調(diào)控機制 例如 : 培養(yǎng)基中乳糖和葡萄糖共存時 → 只有葡萄糖被 利用 原因： CAP位點的正調(diào)控 ? 葡萄糖缺少時 ，腺苷酸環(huán)化酶將 ATP → cAMP ， cAMP與 CAP位點結(jié)合 ,此時啟動子的進(jìn)入位點才能 與 RNApol結(jié)合 ? 葡萄糖存在時， cAMP不能形成，沒有 CAP－ cAMP 與 CAP位點結(jié)合，啟動子的 RNApol進(jìn)入位點不能結(jié) 合 RNApol 因此 ,一個操縱元中有兩道控制開關(guān) ,只有同時打開 ,結(jié)構(gòu)基因才 能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。 （對 lac操縱元而言，只有沒有葡萄糖，有乳糖時才能進(jìn)行錄） （ 1） CAP位點的組成 （－ 70 ～ － 40） 位點 Ⅰ ：－ 70 ～ － 50 包括一個 IR 序列 強結(jié)合位點 位點 Ⅱ ：－ 50 ～ － 40 弱結(jié)合位點 位點 Ⅰ 對位點 Ⅱ 具有協(xié)同效應(yīng)（ cooperativity） （ 2） 位點 Ⅱ 結(jié)合 CAP－ cAMP復(fù)合物后，促使 RNApol進(jìn)入 Sextama Box,最終與－ 10序列結(jié)合起始轉(zhuǎn)錄 原因： CAP－ cAMP復(fù)合物與位點 Ⅱ 結(jié)合 → Sextama Box 富含 （ ）穩(wěn)定性降低 → Pribnow Box 的溶解溫度降低 → 促進(jìn)開放型啟 動子復(fù)合物的形成 → 促進(jìn)轉(zhuǎn)錄 RNApol 在 DNA上結(jié)合位點的鑒定 DNase 法 40bp 而足跡法（ footprinting） 結(jié)果相對準(zhǔn)確 足跡法原理： ? 限制酶切割結(jié)合有 RNApol的 DNA → 大分子 DNA ? 末端標(biāo)記該 DNA（ Klenow片段標(biāo)記 3′,堿性磷酸酯 酶標(biāo)記 5′） ? 用內(nèi)切酶降解 DNA（控制反應(yīng)條件） ? 凝膠電泳分離，放射自顯影觀察 限制酶切 分離 大片段 DNA 末端標(biāo)記大分子 DNA 重新結(jié)合 RNApol 作對照 直接用 DNase 進(jìn)行降解 電泳 用微量 DNase降解 電泳 ? 用足跡法鑒定出來的 RNApol 與 DNA的結(jié)合區(qū)域為 +20 ~ － 50（－ 40），大約 60 ~ 70 bp ? 實驗中還發(fā)現(xiàn) …………….. 實驗中還發(fā)現(xiàn) DNA的兩條鏈?zhǔn)? RNApol 的保護程度不同，說明 RNApol與兩條鏈的結(jié)合是不對稱的，表明轉(zhuǎn)錄只需要一條模板，即單鏈轉(zhuǎn)錄 RNA聚合酶保護法 開始轉(zhuǎn)錄 T T G A C A A A C T G T 35 區(qū) T A T A A T Pu A T A T T A Py 10 區(qū) 1 30 50 10 10 40 20 5 ? 3 ? 3 ? 5 ? 原核生物啟動子保守序列 5? 5? RNA聚合酶保護區(qū) 結(jié)構(gòu)基因 3? 3? N1 7 T T A A C TN7AN1 6 T A T G A TN7AN1 7 T A T G T TN6AN1 6 T A T A A TN7AN1 8 T A C T G TN6AT T T A C AT T T A C AT T G A C AT T G A T AC T G A C Gt r pt R N AT r pl a cr e c Aa r a－ 　 區(qū) － 　 區(qū)3 5 1 0 + 1最 大 一 致 性 T T G A C A T A T A A Tx / 4 53 8 3 6 2 93 7 3 7 2 84 0 2 5 3 04 1 2 9 4 4 原核生物啟動子 － 35區(qū)： 一致性序列為 TTGACA 是 RNApol的 辨認(rèn)位點 － 10區(qū)： 一致性序列為 TATAAT 又叫 Pribnow盒 是 RNApol的 結(jié)合位點 真核生物啟動子結(jié) 構(gòu) 基 因G C G C C A A T T A T A內(nèi) 含 子外 顯 子 外 顯 子轉(zhuǎn) 錄 起 始C A A T 盒G C 盒增 強 子順 式 作 用 元 件T A T A 盒 ( H o g n e s s b o x ) 啟動子各位點與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系 （ 1）－ 35 序列與－ 10 序列與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系 標(biāo)準(zhǔn)啟動子 － 35 TTGACA － 10 TATAAT 不同的啟動子 a. 與標(biāo)準(zhǔn)啟動子序列同源性越高 → 啟動強度越大 b. 與標(biāo)準(zhǔn)啟動子同源性越低 → 啟動強度越小 c. 與標(biāo)準(zhǔn)啟動子差異很大時 → 由另一種 σ因子啟動 原因 : ? － 35序列通過被 σ因子識別的容易 → 決定啟動子強度 ? － 10序列影響開放型啟動子復(fù)合物形成的速度 → 決定啟動子強度 ? 啟動子上升突變、啟動子下降突變 （ 2） － 35序列與－ 10序列的間隔區(qū)與轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)系 ◆ 堿基序列并不重要 ◆ 間距非常重要 ， 17bp的間距轉(zhuǎn)錄效率最高 ◆ 間距上的突變種類： 間距趨向于 17bp → 上升突變 間距遠(yuǎn)離 17bp → 下降突變 σ識別的啟動子的序列 由含 ?70RNA多聚酶全酶識別的典型大腸桿菌啟動子 啟動子區(qū)的識別 ? 在啟動子區(qū) DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中，腺嘌呤、鳥嘌呤和胞嘧啶上的某些基團是 氫鍵供體 ，而 4種堿基中的某些基團是 氫鍵受體 。由于它們分別處于 DNA雙螺旋的 大溝或小溝內(nèi) ，因此都具有特定的方位，而酶分子中也有處于特定空間構(gòu)象的氫鍵受體與供體，當(dāng)它們與啟動子中對應(yīng)的分子在一定距離內(nèi)互補時，就形成氫鍵，相互結(jié)合。 RNA聚合酶不直接識別堿基對本身， 是通過氫鍵互補的方式識別啟動子的 酶與啟動子區(qū)的結(jié)合 ? 在 RNA聚合酶與啟動子相互作用的過程中，聚合酶首先與啟動子區(qū)閉合雙鏈 DNA相結(jié)合，形成二元閉合復(fù)合物，然后經(jīng)過解鏈得到二元開鏈復(fù)合物。解鏈區(qū)一般在 9～ +13之間 ，而酶與啟動子結(jié)合的主要區(qū)域在其 上游 。 ? 一旦開鏈區(qū)解鏈，酶分子能以正確的取向與解鏈后的有關(guān)單鏈相互作用，形成開鏈復(fù)合物。 因此， RNA聚合酶既是雙鏈 DNA結(jié)合蛋白，又是單鏈 DNA結(jié)合蛋白。 DNA開鏈?zhǔn)前凑?DNA模板序列正確引入核苷酸底物的必要條件。 10區(qū)和 35區(qū)的最佳間距 ? 在原核生物中， 35區(qū)與 10區(qū)之間的距離大約是 16～ 19bp ?保持啟動子這二段序列以及它們之間的距離都是重要的，否則就會改變它所控制基因的表達(dá)水平。 ? 因為增減 bp ， 35區(qū)相對于 10區(qū)旋轉(zhuǎn)（增減一個 bp會使兩者之間的夾角發(fā)生 36176。 的變化）所產(chǎn)生的 超螺旋會發(fā)生改變。 若要使酶與 DNA在這個區(qū)域內(nèi)保持正確的取向，就必須使二者之一發(fā)生扭曲，需要增加結(jié)合自由能。 細(xì)菌中常見兩種啟動子突變 下降突變 (down mutation) 上升突變 (up mutation) 如果把 Pribnow區(qū)從TATAAT變成 AATAAT就會大大降低其結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄水平 。 增加 Pribnow區(qū)共同序列的同一性。例如，在乳糖操縱子的啟動子中，將其 Pribnow區(qū)從TATGTT變成 TATATT，就