【文章內(nèi)容簡介】 A蛋白識別， 在原點由 DnaB蛋白（解螺旋酶）將雙螺旋解開成單鏈狀態(tài)，分別作為模板，合成其互補鏈 (DNA雙鏈的解開還需 DNA拓撲異構(gòu)酶 Π 、 SSB),在原點處形成一個眼狀結(jié)構(gòu)，叫復制眼。 ? DNA復制 進行時，在眼的兩側(cè)出現(xiàn)兩個叉子狀的生長點 (growth point)， 叫 復制叉 (replication forks)。在復制叉上分布著各種與復制有關(guān)的酶和蛋白因子，它們構(gòu)成的復合物稱為 復制體（ replisome） 復制叉 復制叉 復制叉 起點 復制叉 延伸 延伸 起點 領(lǐng)頭鏈 領(lǐng)頭鏈 隨后鏈 隨后鏈 3’ 5’ 3’ 5’ DNA的雙向復制 (1)復制的起始 ① 互相纏繞的雙鏈母本 DNA， 復制從特定的位置 (復制原點 OriC or O)開始，該位置常是富含 A、 T區(qū)段。 4拷貝 9bp重復序列 3拷貝 13bp富含 AT序列 ② DNA解螺旋酶 (DnaB)打開局部雙鏈， SSBP與每條單鏈結(jié)合 ,穩(wěn)定單鏈并防止 DNA復性 。然后在 DNA旋轉(zhuǎn)酶 （ TOPⅡ) 的作用下，使螺旋DNA局部變成松弛態(tài)。 ③ 起始因子、引物酶、 DNA聚合酶 等隨后結(jié)合， 引發(fā)體在復制叉上移動， DnaB蛋白活化引物合成酶 ,引發(fā) RNA引物的合成。 領(lǐng)頭鏈 先引發(fā)開始合成，以原來一條 DNA單鏈為模板（ 3’ ? 5’ ),按 5’ ? 3’ 的方向合成一段 RNA引物鏈。領(lǐng)頭鏈開始合成后，后隨鏈也開始合成其引物。引物長度約為幾個至 10個核苷酸，在引物的 5’ 端含 3個磷酸殘基（ 引物酶的底物是核苷三磷酸 ）， 3’ 端為游離的 OH。 （ 2） RNA引物的合成 5 5 3 領(lǐng)頭鏈 (leading strand) 后隨鏈 (lagging strand) 5 3 5 3 在 DNA聚合酶 Ш 的催化下，以四種脫氧核糖核苷 5’ 三磷酸為底物，在 RNA引物的 3’ 端以磷酸二酯鍵連接上脫氧核糖核苷酸并釋放出焦磷酸。 DNA鏈的延伸同時進行 ,領(lǐng)頭鏈和后隨鏈兩條鏈的合成方向相反。 （ 3） DNA鏈的延伸 領(lǐng)頭鏈 — 在 DNA復制時，合成方向與復制叉移動的方向一致并連續(xù)合成的鏈。 隨后鏈 — 在 DNA復制時，合成方向與復制叉移動的方向相反，形成許多不連續(xù)的片段，最后再連成一條完整的 DNA鏈。 半不連續(xù)復制 — 在 DNA復制時，領(lǐng)頭鏈是連續(xù)合成的 ,而隨后鏈的合成是不連續(xù)的，這種復制方式稱為半不連續(xù)復制。 ?半不連續(xù)復制的發(fā)現(xiàn)（ 1968）： 同位素實驗， 3H標記 dT 短時間內(nèi)檢測為 DNA小片段，片段的長度為 1000～ 2022核苷酸殘基，后來稱為崗崎片段 一段時間后 檢測到 DNA大片段。當用 DNA連接酶 的變異株時，檢測到大量小 DNA片段的積累。 —— 證明 DNA復制中有小片段合成。 岡崎片段（ Okazaki fragments） 在 DNA復制過程中，領(lǐng)頭鏈能連續(xù)合成，而隨后鏈只能是斷續(xù)的合成 5??3 ?的多個短片段，這些不連續(xù)的小片段以其發(fā)現(xiàn)者的名字命名為岡崎片段。 岡崎片段大?。? 真核生物： 100200個核苷酸（核小體的 DNA單位）。 原核生物： 10002022個核苷酸（相當于一個順反子）。 蛋白 Mr 亞基 數(shù) 功能 SSB 75600 4 結(jié)合單鏈 DNA DnaB蛋白 (解螺旋酶 ) 300000 6 DNA解螺旋 ,引物體成分 引物酶 (DnaG蛋白 ) 60000 1 RNA引物合成 ,引物體成分 DNA聚合酶 Ⅲ 900000 18~20 新鏈延長 DNA聚合酶 I 103000 1 除去引物 ,填充缺口 DNA連接酶 74000 1 連接 DNA旋轉(zhuǎn)酶 (DNA拓撲異構(gòu)酶 Ⅱ ) 400000 4 去除正超螺旋 參與鏈的延伸階段的蛋白質(zhì)和酶 均以 5/→3 /方向形成前導鏈和滯后鏈 ？ 當新形成的岡崎片段延長至一定長度，其 3’ OH端遇到上一個岡崎片段時即停止合成。 前導鏈合成 隨復制叉移動到起始點即停止復制（大腸桿菌只有一個起始點）。 （ 4）復制終止－－ 切除 RNA引物，填補缺口，連接相鄰的 DNA片段 這時會發(fā)生一系列變化：在 DNA聚合酶 Ⅰ 催化下切除 RNA引物；留下的空隙由 DNA聚合酶 Ⅰ 催化合成一段 DNA填補上；在 DNA連接酶 作用下，連接相鄰的 DNA鏈；修復摻入 DNA鏈的錯配堿基。這樣以兩條親代 DNA鏈為模板，各自形成一條新的 DNA互補鏈。結(jié)果是形成了兩個 DNA雙股螺旋分子。 真核生物中 DNA的復制特點 真核生物染色體有多個復制起點，多復制眼，呈雙向復制，多復制子。 岡崎片段長約 100－ 200bp. 真核生物 DNA復制速度比原核快。 真核生物染色體在全部復制完之前起點不再重新開始復制； 真核生物有多種 DNA聚合酶。 真核生物線性染色體兩端有端粒結(jié)構(gòu)，防止染色體間的末端連接。由端粒酶負責新合成鏈 5?RNA引物切除后的填補，亦保持 端粒的一定長度 。 ?定義 :以 RNA為模板，按照 RNA中的核苷酸順序合成 DNA稱為逆轉(zhuǎn)錄，由 逆轉(zhuǎn)錄酶 催化進行。 ?1970年 Temin和 Baltimore同時分別從勞氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病 RNA病毒中分離出逆轉(zhuǎn)錄酶，迄今已知的致癌 RNA病毒都含有 逆轉(zhuǎn)錄酶 。 用特異抑制物（放線菌素 D） 能抑制致癌 RNA病毒的復制，而對一般 RNA病毒的復制無影響。已知放線菌素 D專門抑制以 DNA為模板的反應(yīng)，可見致癌RNA病毒的復制過程必然涉及到 DNA。 所以 Temin提出前病毒的假說。 四、逆轉(zhuǎn)錄 + RNA+ DNA RNA+ DNA DNA+ ? 病毒 RNA的逆轉(zhuǎn)錄過程 （以前病毒形式引起整合到宿主細胞 DNA中而使細胞惡性轉(zhuǎn)化） 單鏈病毒 RNA RNADNA雜交分子 雙鏈 DNA（ 前病毒） 逆轉(zhuǎn)錄酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 ?逆轉(zhuǎn)錄酶也和 DNA聚合酶一樣，沿 5’ ?3’ 方向合成 DNA， 并要求短鏈 RNA作引物 。 ? 逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶，兼有 3種酶的活性： ? RNA指導的 DNA聚合酶活性 ? DNA指導的 DNA聚合酶活性 ? 核糖核酸酶 H的活性，專一水解 RNADNA雜交 分子中的 RNA ? DNA連接酶，解旋酶的活性 逆轉(zhuǎn)錄酶發(fā)現(xiàn)的理論和實踐意義： 不能把 “ 中心法則 ” 絕對化，遺傳信息也可以從 RNA傳遞到 DNA。 促進了分子生物學、生物化學和病毒學的研究，為腫瘤的防治提供了新的線索。目前逆轉(zhuǎn)錄酶已經(jīng)成為研究這些學科的工具。 1983年，發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒（ human immune deficience virus,HIV） ,感染