蛋白質(zhì)層析技術(shù)ppt課件(編輯修改稿)
2025-02-11 10:40 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 階段洗脫或連續(xù)梯度洗脫 樣品通常特點(diǎn)及對(duì)后續(xù)純化的影響 ? 大多數(shù)蛋白將帶負(fù)電荷，樣品會(huì)含一定量核酸； ? 運(yùn)行層析，則蛋白濃度不應(yīng)大于 10 mg/ml。 ? (NH4)2SO4 沉淀，通常蛋白濃度 15mg/ml. 平臺(tái)的操作（軟件：知識(shí)結(jié)構(gòu)） ? 樣品處理及準(zhǔn)備工作 ? 用 SDSPAGE監(jiān)測整個(gè)流程 ? 富含目標(biāo)蛋白的提取物的獲得：應(yīng)采用盡量低強(qiáng)度的抽提方法。 ? 通常 PBS或 TBS抽提能力過強(qiáng)，沒有必要 .低滲更有利于破碎，甚至可用水進(jìn)行抽提（如 1： 4左右）； 平臺(tái)的操作（軟件：知識(shí)結(jié)構(gòu)） ? 無特殊理由， pH應(yīng)準(zhǔn)確控制在中性附近，盡量用酸性 buffer； ? 緩沖容量：在 pKa附近 緩沖容量正比于緩沖溶液的總濃度； ? 最好運(yùn)用 (NH4)2SO4沉淀，縮小體積，便于保存。終止生化代謝反應(yīng)，除糖、脂類。個(gè)別情形中會(huì)造成不可逆沉淀； 平臺(tái)的操作（軟件：知識(shí)結(jié)構(gòu)） ? 經(jīng)驗(yàn)：具有 3000個(gè)理論塔板的凝膠過濾可近似地將分子量相當(dāng) 2倍的蛋白質(zhì)完全分開；6000個(gè)理論塔板可分開相差 蛋白。 ? 通常，要達(dá)到 3000個(gè)理論塔板的分子排阻層析柱，如用 50μm的介質(zhì)，流速 20cm/h（參照產(chǎn)品說明書）應(yīng)在 80cm以上至120cm，上樣 5%，一般 12%。 平臺(tái)的操作（軟件：知識(shí)結(jié)構(gòu)） ? 實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的層析應(yīng)采用不大于 50 181。m的離子交換或疏水介質(zhì)，應(yīng)具有 10 cm左右，則不少于 600個(gè)理論塔板。 ? 精制：高效預(yù)裝柱 1 5 ml， 10 181。m左右粒度，如 Mono系列等。 ? 通常條件下，采用 15 181。m的 Resource精制也可以達(dá)到較好效果。 平臺(tái)的操作（軟件：知識(shí)結(jié)構(gòu)） ? ，沒有特殊原因不要使用超聲破碎法。 ? 0176。 C ， 20%蔗糖， 10mM左右緩沖液，含，高滲后，加入低滲液，迅速充分懸浮。如果必要，應(yīng)含 DTT至 2mM左右； ? 均漿液組成原則：離子強(qiáng)度盡量低： ≤50mM，有時(shí)需 DTT，不一定加 EDTA，可考慮加 PMSF，但此時(shí)不宜用 Tris等胺類緩沖
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