【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 (2022) The Plant Cell 20:14821493. （野生型擬南芥） （野生型擬南芥的突變體） P169 為確保熒光檢測(cè)的確實(shí)是靶 DNA， 又設(shè)計(jì)了僅能 與目的 DNA特異結(jié)合的熒光探針 。 TaqMan探針是一段與靶 DNA序列中間部位結(jié)合的單鏈 DNA， 長(zhǎng) 50bp150bp， 該 DNA的 5’和 3’端帶有短波長(zhǎng)和長(zhǎng)波長(zhǎng)兩個(gè)不同熒光基團(tuán) ， 由于彼此距離靠近 ， 在熒光共振能量轉(zhuǎn)移 （ FRET） 作用下發(fā)生熒光淬滅 ， 因而檢測(cè)不到熒光 。 隨著 PCR反應(yīng)的進(jìn)行 ， TaqMan 探針結(jié)合到目的 DNA序列上 ， 并且會(huì)被具有外切酶活性的 Taq DNA聚合酶逐個(gè)切除而降解 。 切下來(lái)的熒光基團(tuán)解除了熒光淬滅的束縛 ， 會(huì)在激發(fā)光下發(fā)出熒光 ， 因此 ， 產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度直接反映了所擴(kuò)增靶 DNA的總量 。 TaqMan 探針實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù) TaqMan探針具有三個(gè)要素。（見(jiàn)P168） 在此狀態(tài)下兩個(gè)熒光基團(tuán)十分接近，不發(fā)熒光。 Ct值是產(chǎn)物熒光強(qiáng)度首次超過(guò)設(shè)定閾值時(shí) ，PCR反應(yīng)所需的循環(huán)數(shù) 。 利用標(biāo)準(zhǔn)曲線 ， 可以確定樣品中待檢測(cè)靶 DNA的絕對(duì)含量 。 用實(shí)時(shí)定量 PCR法分析未知樣品靶基因的絕對(duì)表達(dá)量。（ P169） 5. 2. 5 基因組 DNA文庫(kù)構(gòu)建 把某種生物的基因組 DNA切成適當(dāng)大小 ， 分別與載體組合 ， 導(dǎo)入微生物細(xì)胞 ， 形成克隆 。匯集包含基因組中所有 DNA序列的克隆 （ 理論上每個(gè)序列至少有一個(gè)代表 ） ， 這樣的克隆片段的總匯 ， 稱為基因組 DNA文庫(kù) 。 Clark和 Carbon于 1975年提出公式： N=ln(1p) / ln(1f) 式中： N表示一個(gè)基因組文庫(kù)所應(yīng)該包含的重組克隆數(shù)目； p表示所期望的靶基因在文庫(kù)中出現(xiàn)的概率； f表示重組克隆平均插入片段的長(zhǎng)度與基因組 DNA總長(zhǎng)的比值 。 為獲得整個(gè)基因簇或一個(gè)基因及其兩翼延伸序列 ， 基因組文庫(kù)中的 DNA片段常大于 20kb。以人為例 ， 其基因組大小為 3 109bp 若p=99%， 平均插入片段大小為 20kb， 則N= 105。 構(gòu)建基因組文庫(kù)最常用的是 λ噬菌體載體 （ 克隆能力約 15—20kb） 和限制性內(nèi)切酶部分消化法 。 例如用識(shí)別 4個(gè)核苷酸的核酸限制性內(nèi)切酶 Sau3A， 與 BamHI是一對(duì)同尾酶消化 DNA，由 Sau3A酶切產(chǎn)生的 DNA片段可插入到經(jīng)BamHI消化的 λ噬菌體載體上 。 用 Sau3A限制性核酸內(nèi)切酶消化真核生物基因組 DNA并利用 ?噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫(kù)的過(guò)程圖示 。 λ噬菌體作為克隆載體 此外 ， 還有很多大容量克隆載體 ， 如柯斯質(zhì)粒 、細(xì)菌人工染色體 （ BAC） 、 P1源人工染色體（ PAC） 、 酵母人工染色體 （ YAC） 等都可用于基因組文庫(kù)的構(gòu)建 。 它們的優(yōu)點(diǎn)是可以插入更大片段 DNA， 但是穩(wěn)定性一般較差 ， 在大量復(fù)制的過(guò)程中容易出現(xiàn)缺失現(xiàn)象 。 操作也相對(duì)較困難 。 5. 3 RNA基本操作技術(shù) 真核生物基因組 DNA龐大 ， 有大量重復(fù)序列 ， 很難直接分離得到靶基因片段 。 而cDNA來(lái)自反轉(zhuǎn)錄的 mRNA， 無(wú)冗余序列 ，通過(guò)篩選 cDNA文庫(kù) ， 可較快地分離到相關(guān)基因 。 細(xì)胞中的總 RNA包括 mRNA， rRNA ， tRNA以及一些小 RNA（ sRNA） 。 一個(gè)典型的動(dòng)物細(xì)胞約含 105μg RNA， 其中： ?80%85%為 rRNA ?15%20%為 tRNA及 sRNA ?mRNA約占總 RNA 的 1%5% rRNA分子具有確定的大小和核苷酸序列，特別是 28S和 18S特征性條帶是電泳鑒定總 RNA純度和完整性的重要參數(shù)。 Li Q et al. (2022) J. Integr. Plant Biol. 48: 114120. 圖 514 PolyATtract mRNA的分離純化過(guò)程簡(jiǎn)圖。 RNA的濃度和純度可以通過(guò)測(cè)定其 OD260和OD280 來(lái)判斷 。 OD260 為 1時(shí)相當(dāng)于濃度為40μg/ml， 而 OD260/OD280的比值如果在 之間 ， 表示所提取的 RNA純度較好 ， 如果樣品中有蛋白質(zhì)或酚污染 ， 則 OD260/ OD280的比值將明顯低于 。 由于 RNA分子敏感脆弱 ， 在自然狀態(tài)下難以被擴(kuò)增 ， 為了研究 mRNA所包含的功能基因信息 ，一般將其反轉(zhuǎn)錄成穩(wěn)定的 DNA雙螺旋 （ cDNA，plementary DNA） ， 再插入到可以自我復(fù)制的載體中 。 圖 515 cDNA合成過(guò)程示意圖。 圖 516 定向 cDNA 合成及分子修飾 因?yàn)榻^大多數(shù)大腸桿菌細(xì)胞都會(huì)切除帶有 539。甲基胞嘧啶的外源 DNA， 所以實(shí)驗(yàn)中常選用mcrA mcrB菌株以防止 cDNA被降解 。 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 cDNA的長(zhǎng)度一般在 kb之間，質(zhì)粒載體和噬菌體類(lèi)載體都能滿足要求。 cDNA文庫(kù)常用 Unizap XR（一種 λ噬菌粒載體）做載體，它具備噬菌體的高效性和質(zhì)粒載體系統(tǒng)利用藍(lán)白斑篩選的便利，可容納010 kb DNA插入片段，含有 pBluescript載體的全部序列。 重組后可通過(guò)體內(nèi)剪切反應(yīng)（ In Vivo Excision）將 cDNA插入片段轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒系統(tǒng)中進(jìn)行篩選、克隆和序列分析。 基因文庫(kù)的篩選 基因文庫(kù)的篩選是指通過(guò)某種特殊方法從基因文庫(kù)中鑒定出含有所需重組 DNA分子的特定克隆的過(guò)程 。 篩選的方法有很多種 ， 如核酸雜交法 ， PCR篩選法和免疫篩選法等 。 核酸雜交法： 核酸雜交法以其廣泛的適用性和快速性成為基因文庫(kù)篩選中最常用的一種方法 ， 用放射性標(biāo)記的特異 DNA探針適用于高密度的菌落雜交篩選 。 將待篩選菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上 ， 適當(dāng)溫育 。 同時(shí)保留原來(lái)的菌落平板作對(duì)照 。 取出已經(jīng)長(zhǎng)有菌落的膜 ， 用堿液處理 ， 使菌落發(fā)生裂解 ， DNA隨之變性 。 用蛋白酶 K處理硝酸纖維素膜去除蛋白質(zhì) ， 形成菌落 DNA的印跡 。 80℃ 烘烤濾膜 ， 將 DNA固定在膜上 。 將濾膜與放射性標(biāo)記的 DNA或 RNA探針雜交 ， 通過(guò)放射性自顯影顯示雜交結(jié)果 。 通過(guò)對(duì)應(yīng)于平板上的位置找到相應(yīng)克隆 。 圖 517 通過(guò)核酸雜交篩選目的克隆流程圖 PCR篩選法 將整個(gè)文庫(kù) （ 以質(zhì)粒的形式或者細(xì)菌的形式均可 ） 保存在 多孔培養(yǎng)板上 ， 用設(shè)計(jì)好的目的基因探針對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行 PCR篩選 ， 鑒定出陽(yáng)性的孔 ， 把每個(gè)陽(yáng)性孔中的克隆再稀釋到次級(jí)多孔板中進(jìn)行 PCR篩選 。 重復(fù)以上程序 ， 直到鑒定出與目的基因?qū)?yīng)的單個(gè)克隆為止 。 免疫篩選法 該法僅適用于對(duì)表達(dá)文庫(kù)的篩選 。 若實(shí)驗(yàn)中靶基因的序列完全未知但是有針對(duì)該基因產(chǎn)物的