垂直板聚丙烯酰胺凝膠連續(xù)電泳分離乳酸脫氫酶同工酶(編輯修改稿)
2025-02-04 06:51 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 帶電泳，是利用蛋白質(zhì)分子的電荷效應(yīng)進(jìn)行分離，凝膠的分子篩效應(yīng)不明顯，一般只用于分離一些比較簡單的樣品，缺點(diǎn)是分辨率不高。優(yōu)點(diǎn)是制膠簡單快捷，緩沖系統(tǒng)的 pH恒定，可以防止樣品進(jìn)膠后因 pH變化發(fā)生凝聚和沉淀，緩沖系統(tǒng)組成簡單。 12 不連續(xù)系統(tǒng) 是指使用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系的電泳方式，在電泳分離過程中，由于濃縮膠的堆積作用，可使樣品在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，對樣品進(jìn)行濃縮，然后在一定濃度或濃度梯度的凝膠上進(jìn)行分離，既存在電荷效應(yīng)，也有分子篩效應(yīng)。雖然制膠操作難度較大，但是它具有連續(xù)系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)越性，分辨率高。 不連續(xù)電泳的 四個不連續(xù)性 凝膠濃度的不連續(xù)性；緩沖液離子成分的不連續(xù)性；緩沖液 pH梯度的不連續(xù)性；電位梯度的不連續(xù)性 。 13 關(guān)于乳酸脫氫酶 1959年 Markert等用電泳的方法將純化的心肌乳酸脫氫酶 (LDH)分離出 5條區(qū)帶，由陽極到陰極依次命名為 LDH LDH LDHLDH LDH5，它們均具有 LDH催化活性，從而首先提出了同工酶的概念。目前已知 LDH同工酶是由 H和 M亞基按不同比例組成的四聚體。 LDH同工酶廣泛存在于動植物及微生物中，動物各組織中 LDH同工酶各組分含量不同。臨床上對 LDH及同工酶的檢測可作為某些疾病診斷的依據(jù)之一。 14 乳酸脫氫酶同工酶活性染色 用活性染色對 LDH進(jìn)行鑒定，將凝膠浸泡在活性染色液中， LDH與底物的反應(yīng)，用甲硫吩嗪 (PMS)作為電子的中間載體，氯化硝基四氮唑藍(lán) (NBT)作為最終電子受體，底物脫下的氫最后傳遞給 NBT， NBT被還原后，產(chǎn)生藍(lán)紫色的不溶于水的物質(zhì)以對 LDH定位。反應(yīng)式如下： 15 LDH4 LDH3 LDH5 LDH1 LDH2 1 2 3 4 電泳結(jié)果實(shí)例 16 電泳裝置 采用 Pharmacia公司的 SE250小型夾心式垂直板電泳裝置： ? 制膠裝置 制備凝膠板 ? 電泳裝置 進(jìn)行凝膠電泳 每組（ 2人）做一塊膠，兩組共用一套電泳裝置，兩套電泳槽共用一臺電泳儀。 17 18 操
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