垂直板聚丙烯酰胺凝膠連續(xù)電泳分離乳酸脫氫酶同工酶-文庫(kù)吧資料
2025-01-14 06:51本頁(yè)面
【正文】 骨骼肌、肝臟、心肌 和 腦 組織，加入 5倍組織重的勻漿緩沖液，用玻璃勻漿器勻漿，離心 (10 000 r /min， 15 min)，吸出上清液，加入等體積 40 %的蔗糖（含少許溴酚藍(lán)）混勻，放置 4℃ 冰箱中備用。 14 乳酸脫氫酶同工酶活性染色 用活性染色對(duì) LDH進(jìn)行鑒定，將凝膠浸泡在活性染色液中， LDH與底物的反應(yīng)，用甲硫吩嗪 (PMS)作為電子的中間載體，氯化硝基四氮唑藍(lán) (NBT)作為最終電子受體，底物脫下的氫最后傳遞給 NBT， NBT被還原后，產(chǎn)生藍(lán)紫色的不溶于水的物質(zhì)以對(duì) LDH定位。 LDH同工酶廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中，動(dòng)物各組織中 LDH同工酶各組分含量不同。 13 關(guān)于乳酸脫氫酶 1959年 Markert等用電泳的方法將純化的心肌乳酸脫氫酶 (LDH)分離出 5條區(qū)帶，由陽(yáng)極到陰極依次命名為 LDH LDH LDHLDH LDH5，它們均具有 LDH催化活性，從而首先提出了同工酶的概念。雖然制膠操作難度較大，但是它具有連續(xù)系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)越性，分辨率高。優(yōu)點(diǎn)是制膠簡(jiǎn)單快捷，緩沖系統(tǒng)的 pH恒定，可以防止樣品進(jìn)膠后因 pH變化發(fā)生凝聚和沉淀，緩沖系統(tǒng)組成簡(jiǎn)單。多數(shù)蛋白質(zhì)的pI在中性偏酸性范圍，通常是將樣品在堿性緩沖系統(tǒng)中進(jìn)行電泳，蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷，以不同速度向陽(yáng)極遷移，稱為 陽(yáng)極電泳 ；對(duì)于一些堿性蛋白，使用酸性緩沖系統(tǒng)進(jìn)行電泳，蛋白質(zhì)分子帶正電荷而向陰極遷移，稱為 陰極電泳 。 9 凈電荷聚丙烯酰胺凝膠電泳 分離蛋白質(zhì)的原理 凈電荷聚丙烯酰胺凝膠電泳是對(duì)天然狀態(tài)生物大分子進(jìn)行的電泳，目的是為了保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象、其亞基之間的相互作用及其生物學(xué)活性。在實(shí)際工作中，常依據(jù)待分離蛋白質(zhì)已知相對(duì)分子質(zhì)量的大小來(lái)選擇所合適的凝膠濃度，使蛋白質(zhì)混合物得到最大限度的分離，大多數(shù)蛋白質(zhì)在 %凝膠中能得到滿意的結(jié)果，所以這個(gè)濃度的凝膠稱為 標(biāo)準(zhǔn)膠 。 %100??? m baT %100??? babC8 凝膠的總質(zhì)量濃度 T和交聯(lián)度 C決定凝膠的有效孔徑。 ? 凝膠 a、 b的比例決定了凝膠的物理性狀。 T為凝膠溶液中單體和交聯(lián)劑的總質(zhì)量濃度， C為凝膠溶液中交聯(lián)劑占單體和交聯(lián)劑總量的質(zhì)量分?jǐn)?shù) 。 ? 雜質(zhì) 某些金屬離子或其它雜質(zhì)也會(huì)影響凝膠的化學(xué)聚合，所以應(yīng)選擇高純度的 A
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