食品安全快速檢測(cè)技術(shù)7分子雜交技術(shù)(編輯修改稿)
2025-02-02 10:14 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 成反比，在相同轉(zhuǎn)移率（ 50%）時(shí)，真空法比毛細(xì)管法快 13倍，其損失僅 6%，而毛細(xì)管法損失率20%。 v. 各種轉(zhuǎn)移方法的比較 i) 擴(kuò)散法和毛細(xì)管法：操作簡(jiǎn)便，不需要特殊轉(zhuǎn)移儀器，但轉(zhuǎn)移效率低 ,（擴(kuò)散法為 70%，毛細(xì)管法 80%）耗時(shí)多。 ii) 電轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時(shí)少，需特殊轉(zhuǎn)移儀，對(duì)轉(zhuǎn)移條件要求較嚴(yán)。 iii) 真空轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時(shí)最少，需特殊真空轉(zhuǎn)移儀。 vi. 轉(zhuǎn)移的最佳條件 i) 固定基質(zhì)的選擇 ii) 轉(zhuǎn)移前預(yù)處理： DNA和 RNA分子變性，蛋白質(zhì)則需除去凝膠中的 SDS。 iii)大分子的轉(zhuǎn)移 對(duì)于分子量較大的 DNA片段 ，必須進(jìn)行 原位斷裂 后再進(jìn)行轉(zhuǎn)移，斷裂 DNA分子最佳長(zhǎng)度為 12kb。 其步驟是： HCl處理凝膠兩次（每次 15分鐘） → 水洗 → NaOH/1M NaCl兩次，每次 15分鐘 → 轉(zhuǎn)移。 對(duì)于大分子蛋白質(zhì) ，可采用下述三種方法之一： 解偶聯(lián)劑使凝膠解聚；蛋白酶作用；轉(zhuǎn)移緩沖液中加入 SDS。 四 . 標(biāo)記探針的制備 P O P O P O H脫氧核苷脫氧核苷(或 核苷)P O P O H32P腺苷NCH= CHC H NH C ( C H ) 2 2 4CH O PO P OP O H2O 1. 標(biāo)記化合物的種類(lèi) 1）放射性同位素標(biāo)記物 125I， 3H， 14C用于蛋白質(zhì)標(biāo)記； 32P， 3H， 35S用于核酸標(biāo)記，其中 32P和 35S使用頻率高。 32P標(biāo)記核苷酸的 α位或 γ位， 35S則是標(biāo)記核苷酸的 α位 . 2) 非放射性標(biāo)記物 i. 生物素 分離自蛋黃的水溶性維生素，它可以和分離自蛋清中的一種堿性蛋白 — 抗生物素蛋白 牢固地結(jié)合。每個(gè)抗生物素蛋白可結(jié)合 4個(gè)生物素分子。此外，鏈霉菌抗生蛋白與生物素結(jié)合更牢固，可大大提高其靈敏度。 生物素可以經(jīng)過(guò)化學(xué)法與不同的化合物結(jié)合形成標(biāo)記化合物。 ii. 半抗原 包括汞， 2乙酰胺二苯丙茂，地高辛配體和金屬銪。 地高辛配體是一種脂質(zhì)半抗原，可將其連在 dUTP（脫氧尿三磷酸）上，然后用酶將其摻入新合成鏈中。檢測(cè)上述標(biāo)記物的方法是利用二抗 酶偶聯(lián)物反應(yīng)和顯色反應(yīng)。 iii. 蛋白質(zhì)檢測(cè)標(biāo)記物 i) 酶偶聯(lián)二抗 （ ） ii) 蛋白質(zhì) A（ 來(lái)自金黃色葡萄球菌 ） 。 可作用于大多數(shù)哺乳動(dòng)物的 IgG（ 免疫球蛋白 ） ， 靈敏度較低 （ 5ng） iii) 免疫金 （ immunogold） 3) 兩類(lèi)標(biāo)記化合物的比較 i. 靈敏度 i ) 檢測(cè)蛋白質(zhì) ， 兩種方法差不多 。 ii) 檢測(cè)核酸 ， 放射法比酶法敏感 。 ii. 穩(wěn)定性 酶法探針可在 4℃ 保存一年 ， 放射性標(biāo)記需每次制備 。 iii. 安全性 非放射性標(biāo)記安全 。 iv. 效率 非放射性標(biāo)記所需時(shí)間短 。 2. 標(biāo)記探針的制備方法 1）鏈標(biāo)記法 2) 末端標(biāo)記 3) 標(biāo)記化合物的純化 1） 鏈標(biāo)記法 i. 切口移位法 dsDNA+DNase I+DNApol I+dNTP(32PdCTP) ii. 隨機(jī) DNA引物延伸法 dsDNA→ss DNA(6n,t)→Klenow 片段 +dNTP(32P) * * * * * *變性539。 339。339。 539。 iii. 反轉(zhuǎn)錄法 mRNA+dNTP(32P) → cDNA（標(biāo)記） iv. 轉(zhuǎn)錄法 含有待標(biāo)記 DNA片段的重組質(zhì)粒 +NTP(32P)→→RNA （標(biāo)記） SP6聚合酶 v. 引物延伸法 含待標(biāo)記 DNA的單鏈
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