【文章內容簡介】 42微量移液槍：德國Eppendoorf凝膠成像系統(tǒng)、梯度PCR儀T100:美國伯樂電子天平BS224S:北京市賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司恒溫水浴鍋DFD700：北京長安科學儀器廠手提式高壓滅菌鍋YX280B :上海三申醫(yī)療器械有限公司數顯光照培養(yǎng)箱250D、磁力攪拌器791：江蘇省金壇市科興儀器廠電泳儀DYY8C型、電泳槽DYCP31DN、電泳槽DYCP31D：北京六一儀器廠冰箱BCD233：海爾公司超純水系統(tǒng)AFX11001P ：艾科浦國際有限公司DNA Marker、Taq DNA 聚合酶、10PCR Buffer、dNTPs購自大連寶生物工程有限公司。甲叉雙丙烯酰胺，CTAB，EDTA，丙烯酰胺，過硫酸銨，去離子甲酰胺，以及EB，購自Ameresco公司。EDTA、Tris：武漢亞法公司進口分裝SDS、溴酚藍：Sigma公司無水乙醇，異丙醇，異戊醇，冰乙酸，氯仿，考馬斯亮藍，氫氧化鈉，甲醛，硼酸，瓊脂糖，鹽酸等常用生化試劑均采用國產分析純。 主要緩沖液及試劑的配制1) DNA快抽溶液Ⅰ：稱取1g NaOH 固體粉末，補ddH2O至80 ml，攪拌溶解，在定容至100ml，配制成1%的NaOH溶液。2) DNA快抽溶液Ⅱ：取10ml 12M的濃鹽酸溶于470ml水中（ ，:2比例混合（）)。3) TE緩沖液（）：10mM TrisHCl，1mM EDTA（pH ），常溫（量取1 M TrisHCl 10 mL、 EDTA 2mL混勻后定容1L）（pH ），定容50mL。4) ： EDTA ,加入800ml水中，與磁力攪拌器上攪拌溶解，加水溶解定容至1L，滅菌(108℃—115℃ 20min)。5) 1mol/L TrisHCl溶液： Tris，加入到800ml水中，磁力攪拌器上攪拌溶解，,定容至1L,滅菌(108℃115℃ 20min)。6) 70%乙醇：量取無水乙醇70ml,加ddH2O攪拌,定容至100mL。7) 氯仿/乙醇（24:1）：量取異戊醇20ml、氯仿480ml混勻。8) 10%過硫酸銨（APS）：稱取10g APS粉末加入到80ml ddH2O中充分溶解，定容至100ml，4℃避光保存。9) 30%丙烯酰胺溶液配方：稱取290g丙烯酰胺，10g甲叉丙烯酰胺，加ddH2O溶解并定容至1L。10) 50TAE： mL冰乙酸，242 g Tris，100 mL mol/L EDTA（pH ），定容值1L,室溫存放。11) 1TAE:量取20ml 50TAE，加ddH2O定容至1L。12) SDS提取buffer：50 mM/L TrisHCl，pH ； mM/L EDTA，pH ；300 mM/L NaCl；1% SDS，115℃滅菌后使用。13) CTAB提取buffer：100 mM/L TrisHCl，pH ；20 mM/L EDTA，PH ； M/L NaCl；2% CTAB，滅菌后使用。 SSR引物來源本實驗采用中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準 NY/T 14332007 水稻品種鑒定DNA指紋方法，推薦使用的48 對基本核心標記的SSR 引物，引物序列合成于金斯瑞生物科技，標記具體信息見附表1。 方法 田間純度調查田間混雜不育株識別方法：在孝感夏季條件下，鹽兩優(yōu)2208種植田間稻穗包頸、穗頸節(jié)低于于劍葉葉枕的是混有母本鹽220s雜株；母本鹽220s柱頭比鹽兩優(yōu)2208發(fā)達，母本柱頭的外露率高達80%，而鹽兩優(yōu)2208的柱頭外露率約20%；鹽兩優(yōu)2208比鹽220s對“920”更敏感，抽穗期施用一兩次“920”后．田間的鹽兩優(yōu)2208要高出鹽220s一大截；從葉片看, 鹽220s植株的葉片較鹽兩優(yōu)2208稍窄且反卷程度高, 而鹽兩優(yōu)2208在倒3 葉以后無反卷現象；鹽兩優(yōu)2208開花當天花藥飽滿肥大且呈黃色，第二天逐漸變?yōu)闇\褐色，而鹽220s花藥則瘦癟為白色；鹽兩優(yōu)2208一般穗形緊湊，直至灌漿后穗型才變松散，但鹽220s始穗期12天后穗型就開始變的松散。通過以上幾點便可分在抽穗期鑒別出鹽兩優(yōu)2208雜交種中混雜的不育系鹽220s。田間混雜異品種和變異株識別方法：一般為常規(guī)稻種子和其他異株，常規(guī)稻植株較矮小, 莖基部一般為白色,分孽力弱比鹽兩優(yōu)2208弱, 穗頭短, 不包頸, 抽穗期與鹽兩優(yōu)2208不一致，而其他異品種雜交稻生育期與鹽兩優(yōu)2208不一致。 水稻總DNA提取將親本鹽恢88鹽220s和雜交種鹽兩優(yōu)2208的種子于實驗室光照培養(yǎng)箱37℃浸種催芽，親本各保證30株，鹽兩優(yōu)2208保證700株，幼苗于室內培養(yǎng)至5cm，隨機從待檢的鹽兩優(yōu)2208幼苗植株上剪取約4幼嫩葉片，單株分裝，分別采用“熱堿快抽法”和“SDS”分單株提取基因組DNA。參照McCouch的方法，采用“SDS”法提取總DNA，具體步驟如下：① g， EP管中。②加入800uL 65℃預熱的SDS提取buffer(50mM/L TrisHCl，PH=；，PH=；300 mM/L NaCl；l％SDS)，快速搖勻后放置于65℃恒溫水浴鍋中，持續(xù)溫浴50min，期間每隔3分鐘搖動一次，保證抽提液與水稻植株細胞混合充分。取出離心管直至冷卻至室溫。③4℃，10000r／min離心10min，轉移上清至2mL的EP管中，加等體積（400mL）的平衡酚和氯仿：異戊醇(24:1)混勻。④4℃，10 000 r／min離心15 min，加入兩倍體積（800mL）的冰凍無水乙醇混勻，于20℃冰箱冷凍30min以上。⑤4℃，8 000 r／min離心10 min倒掉上清液。用800ul 70％乙醇洗滌，8 000r／min離心5min后倒掉上清，42℃風干10min。與于50μl TE溶解，20℃儲存。運用酸堿快速提取法根據詹慶才介紹的方法略作改進：酸堿快抽法提取水稻基因組DNA，具體步驟如下：取1cm左右的水稻幼苗，加40μl DNA快抽溶液Ⅰ，100℃煮沸30s，然后加60μl緩沖液Ⅱ，100℃煮沸2min，待冷卻至室溫后用作PCR模板。 SSR分子標記的PCR反應體系的優(yōu)化正交設計的PCR反應體系優(yōu)化：反應體系的優(yōu)化實驗材料為鹽兩優(yōu)2208，擴增帶型單一的RM17為引物，對反應體系中各個底物進行正交設計試驗，試驗針對DNA模板添加量、引物添加量、Buffer添加量、Taq 酶添加量、dNTPs添加量分寫設計4個添加量梯度，共16 個處理如表22，最后用ddH2O補至25μl。擴增產物檢測采用濃度為3%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后3min，凝膠成像拍照。表22 正交設計的16組PCR反應體系的各反應底物添加量體系編號模板（μl）dNTP（μl）引物（μl）Taq酶（μl）Buffer（μl）1123124511617112819110111212132114215212162PCR反應程序如下：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s，35個循環(huán)；最后一個循環(huán)72 ℃，延伸8 min，4 ℃保存。PCR反應產物經瓊脂糖凝膠電泳或者聚丙烯胺酰胺凝膠電泳檢測，用EB染色成像拍照并分析實驗結果。 PCR擴增產物電泳檢測 瓊脂糖凝膠電泳1%的瓊脂糖凝膠電泳:，量取30ml 1TAE，用錫箔紙封住瓶口，微波爐加熱1min煮沸，待瓊脂糖全部融化。3%的瓊脂糖凝膠電泳:，量取30ml 1TAE，用錫箔紙封住瓶口，微波爐加熱2min煮沸，待瓊脂糖全部溶化，冷卻至65左右。預先將制膠板和膠槽洗干凈并晾干，將制膠板扣入膠槽，并插上梳子，將事先制好的煮好的瓊脂糖凝膠緩緩倒入制膠板，待凝膠均勻布滿整個制膠板，室溫凝固后，拔出梳子，將制膠板放入水平電泳槽，倒入1TAE直到電泳緩沖液沒過凝膠為止。點樣：將擴增好的 PCR產物與6Loading Buffer以6:1的比例混勻，上樣4μl；電泳：恒壓100V，根據指示劑的位置，取出凝膠，EB染色3min，水槽沖洗，點樣孔也要沖洗干凈，凝膠成像拍照觀察。 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對田間鑒定的雜株進行取樣，對應取樣做SSR標記分析，雜株類型分析采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺電泳具體過程如下：12%的非變膠的配制：在燒杯中依次加入30%、ddH2O 、60μl的加速劑TEMED和10%的（催化劑）過硫酸銨800μl并混勻；用移液槍開始向槽內灌膠，當膠液面升到玻璃板上沿時分，用夾子緊緊夾住膠，使丙烯酰胺至少聚合30min；電泳:等待凝膠完全聚合以后，取下夾子，TBE緩沖液充分浸泡玻璃板，在緩慢取出梳子，清理干凈點樣孔中的氣泡，用200V電壓預電泳8min。上樣：SSR引物擴增出的PCR產物與DNA loddoing buffer按照3:1的比例混合，用10μL的微量移液器點樣4μl。恒電壓U=200V電泳,電泳時間以凝膠板上的藍色指示泳動至至膠版約四分之三處時停止電泳；凝膠染色：電泳結束后，倒干凈緩沖液，擰開垂直電泳槽，螺母，卸下電泳槽上的玻璃板。輕輕的移開兩塊玻璃板，使之分開，緩慢的將聚丙烯酰胺凝膠從玻璃板上剝離下來（切記不可讓膠破裂），用蒸餾水沖洗1min，將凝膠放入EB中染色，染色時間3min，染色完畢后用自來水漂洗干凈，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察和拍照 SSR引物的篩選本實驗通過利用48的SSR引物（附表1）在雙親之間表現出的多態(tài)性，來篩選出在雙親前表現出多態(tài)性良好的引物，要求所篩選的引物盡可能滿足以下條件：SSR引物在雙親間的PCR產物電泳譜帶帶型單一、同一對引物在鹽兩優(yōu)220鹽恢88鹽220s三者相互之間都具有明顯的多態(tài)性。通過引物篩選我們可以找到供試品種的多態(tài)性引物，利用特征引物對種實驗室浸種催芽隨機取樣的供試品種進行SSR標記的純度鑒定。對田間雜株取樣進行SSR帶型分析。共顯性引物篩選：用48對SSR引物分別對鹽兩優(yōu)2208的親本進行擴增，篩選出雙親之間具有共顯性、多態(tài)性的SSR引物。 SSR指紋圖譜譜帶分析對于任意一對SSR引物得到的指紋譜帶，利用成像儀上的軟件計算分子量，計算引物在所有樣品中的復等位位點數目，根據其分子量大小對所有復等位位點從小到大依次進行阿拉伯數字編號。指紋圖譜上的條帶和軟件計算出的等位位點分子量大小相同的則用相同阿拉伯數字編號表示，同時參照聚丙烯酰胺電泳膠上的重復樣品，不同凝膠之間具有參照性，條帶賦值更精確。按此方法，獲得所有指紋圖譜條帶在聚丙烯酰胺凝膠上的多態(tài)性位置編號。成像儀軟件計算的條帶值是根據Marker條帶值估計出來的，可作為實驗的參考值。 統(tǒng)計分析方法SSR標記純度鑒定是，目前通常是取樣100或者200株提取DNA，從統(tǒng)計學的角度，為了保證實驗數據的準確科學性以及SSR純度鑒定的效率，分析不同樣本量時的純度。為比較田間種植鑒定和SSR分子鑒定在統(tǒng)計學上是否存在差異，分別記錄5對多態(tài)性的引物在檢測樣本數為100、200、300、400、500各個整百點時的純度，將5對引物之間的相同樣本數時的純度求平均值，對比調查孝感和海南田間1000株群體的純度，SSR分子標記純度鑒定所需的最少樣本量，便可以滿足田間1000株取樣調查純度的要求。 純度計算方法通過田間表型鑒定與SSR標記鑒定出各試驗材料的純度，其計算公式如下：%鑒定總株數雜株數鑒定總株數純度= 田間雜株類型的分析為了檢測田間雜株中可能混有的異品種、變異品種，通過田間觀察鹽兩優(yōu)2208具體的表型，區(qū)分出不同的雜株類型，將田間鑒定出的雜株葉片分單株取樣分裝帶回實驗室，對各個雜株進行SSR分析，對比雙親條帶，如果通過瓊脂糖凝膠電泳無法區(qū)分出變異株和異品種，則進一步采用分辨率更高的非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳。19第三章 結果與分析第三章 結果與分析 鹽兩優(yōu)2208田間雜株鑒定為了消除環(huán)境對水稻植株田間鑒定表現型的影響，降低試驗誤差,更準確地比較SSR分子鑒定與田間鑒定方法的差異,判斷用SSR鑒定代替田間鑒定的可行性與可靠性,并在海南和孝感2個環(huán)境中進行。田間鑒定樣本為每重復1000株，鹽兩優(yōu)2208在海南和孝感兩地的田間檢測純度如31。表31 孝感和海南田間純度鑒定結果試驗地 純度海南%孝感97%田間純度鑒定的鹽兩優(yōu)2208的總株數為1000，孝感檢測出的雜株數量為30株，純度為97%，海南檢測出的雜株數量為26株，純度為 %，具體結果如表32。從田間鑒定的結果可以看出，鹽兩優(yōu)2208在制種過程中操作嚴格，沒有父本混雜，且植株生長過程中母本自交結實的比重為6‰，證明了該品種的純度很高。表32 孝感田間雜株類型及數量父本母本變異株或異品種00662323 兩種方法提取模板DNA及對應模板的PCR檢測對比“熱堿快抽法”和“SDS法”這兩種基因組DNA抽提法的效果（如圖31a）,分別將兩種方法提取的模板用SSR分子檢測，各自的檢測結果如圖（31b、31c、31d），比較發(fā)現，“SDS法”提取的模板DNA質量明顯要優(yōu)于“熱堿快抽法”提取的模板DNA質量，通過進一步的SSR檢測發(fā)現，當加入相同體積（）的模板時，“SDS法”的PCR擴增產物量要高于“熱堿快抽法”的產物量，當加大熱堿快抽法的模板添加量時，其PCR擴增產物量有明顯的增加，實驗證明了通過增加（熱堿快抽法）的模板添加量時，可以用熱堿快抽法取代“SDS法”用于本實驗的模板DNA的提取。圖31a 兩種方法提取的總DNA 注：M：EcoT14Ⅰdigest DNA m