【文章內(nèi)容簡介】 42微量移液槍：德國Eppendoorf凝膠成像系統(tǒng)、梯度PCR儀T100:美國伯樂電子天平BS224S:北京市賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司恒溫水浴鍋DFD700：北京長安科學(xué)儀器廠手提式高壓滅菌鍋YX280B :上海三申醫(yī)療器械有限公司數(shù)顯光照培養(yǎng)箱250D、磁力攪拌器791：江蘇省金壇市科興儀器廠電泳儀DYY8C型、電泳槽DYCP31DN、電泳槽DYCP31D：北京六一儀器廠冰箱BCD233：海爾公司超純水系統(tǒng)AFX11001P ：艾科浦國際有限公司DNA Marker、Taq DNA 聚合酶、10PCR Buffer、dNTPs購自大連寶生物工程有限公司。甲叉雙丙烯酰胺，CTAB，EDTA，丙烯酰胺，過硫酸銨，去離子甲酰胺，以及EB，購自Ameresco公司。EDTA、Tris：武漢亞法公司進(jìn)口分裝SDS、溴酚藍(lán)：Sigma公司無水乙醇，異丙醇，異戊醇，冰乙酸，氯仿，考馬斯亮藍(lán)，氫氧化鈉，甲醛，硼酸，瓊脂糖，鹽酸等常用生化試劑均采用國產(chǎn)分析純。 主要緩沖液及試劑的配制1) DNA快抽溶液Ⅰ：稱取1g NaOH 固體粉末，補(bǔ)ddH2O至80 ml，攪拌溶解，在定容至100ml，配制成1%的NaOH溶液。2) DNA快抽溶液Ⅱ：取10ml 12M的濃鹽酸溶于470ml水中（ ，:2比例混合（）)。3) TE緩沖液（）：10mM TrisHCl，1mM EDTA（pH ），常溫（量取1 M TrisHCl 10 mL、 EDTA 2mL混勻后定容1L）（pH ），定容50mL。4) ： EDTA ,加入800ml水中，與磁力攪拌器上攪拌溶解，加水溶解定容至1L，滅菌(108℃—115℃ 20min)。5) 1mol/L TrisHCl溶液： Tris，加入到800ml水中，磁力攪拌器上攪拌溶解，,定容至1L,滅菌(108℃115℃ 20min)。6) 70%乙醇：量取無水乙醇70ml,加ddH2O攪拌,定容至100mL。7) 氯仿/乙醇（24:1）：量取異戊醇20ml、氯仿480ml混勻。8) 10%過硫酸銨（APS）：稱取10g APS粉末加入到80ml ddH2O中充分溶解，定容至100ml，4℃避光保存。9) 30%丙烯酰胺溶液配方：稱取290g丙烯酰胺，10g甲叉丙烯酰胺，加ddH2O溶解并定容至1L。10) 50TAE： mL冰乙酸，242 g Tris，100 mL mol/L EDTA（pH ），定容值1L,室溫存放。11) 1TAE:量取20ml 50TAE，加ddH2O定容至1L。12) SDS提取buffer：50 mM/L TrisHCl，pH ； mM/L EDTA，pH ；300 mM/L NaCl；1% SDS，115℃滅菌后使用。13) CTAB提取buffer：100 mM/L TrisHCl，pH ；20 mM/L EDTA，PH ； M/L NaCl；2% CTAB，滅菌后使用。 SSR引物來源本實(shí)驗(yàn)采用中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) NY/T 14332007 水稻品種鑒定DNA指紋方法，推薦使用的48 對基本核心標(biāo)記的SSR 引物，引物序列合成于金斯瑞生物科技，標(biāo)記具體信息見附表1。 方法 田間純度調(diào)查田間混雜不育株識別方法：在孝感夏季條件下，鹽兩優(yōu)2208種植田間稻穗包頸、穗頸節(jié)低于于劍葉葉枕的是混有母本鹽220s雜株；母本鹽220s柱頭比鹽兩優(yōu)2208發(fā)達(dá)，母本柱頭的外露率高達(dá)80%，而鹽兩優(yōu)2208的柱頭外露率約20%；鹽兩優(yōu)2208比鹽220s對“920”更敏感，抽穗期施用一兩次“920”后．田間的鹽兩優(yōu)2208要高出鹽220s一大截；從葉片看, 鹽220s植株的葉片較鹽兩優(yōu)2208稍窄且反卷程度高, 而鹽兩優(yōu)2208在倒3 葉以后無反卷現(xiàn)象；鹽兩優(yōu)2208開花當(dāng)天花藥飽滿肥大且呈黃色，第二天逐漸變?yōu)闇\褐色，而鹽220s花藥則瘦癟為白色；鹽兩優(yōu)2208一般穗形緊湊，直至灌漿后穗型才變松散，但鹽220s始穗期12天后穗型就開始變的松散。通過以上幾點(diǎn)便可分在抽穗期鑒別出鹽兩優(yōu)2208雜交種中混雜的不育系鹽220s。田間混雜異品種和變異株識別方法：一般為常規(guī)稻種子和其他異株，常規(guī)稻植株較矮小, 莖基部一般為白色,分孽力弱比鹽兩優(yōu)2208弱, 穗頭短, 不包頸, 抽穗期與鹽兩優(yōu)2208不一致，而其他異品種雜交稻生育期與鹽兩優(yōu)2208不一致。 水稻總DNA提取將親本鹽恢88鹽220s和雜交種鹽兩優(yōu)2208的種子于實(shí)驗(yàn)室光照培養(yǎng)箱37℃浸種催芽，親本各保證30株，鹽兩優(yōu)2208保證700株，幼苗于室內(nèi)培養(yǎng)至5cm，隨機(jī)從待檢的鹽兩優(yōu)2208幼苗植株上剪取約4幼嫩葉片，單株分裝，分別采用“熱堿快抽法”和“SDS”分單株提取基因組DNA。參照McCouch的方法，采用“SDS”法提取總DNA，具體步驟如下：① g， EP管中。②加入800uL 65℃預(yù)熱的SDS提取buffer(50mM/L TrisHCl，PH=；，PH=；300 mM/L NaCl；l％SDS)，快速搖勻后放置于65℃恒溫水浴鍋中，持續(xù)溫浴50min，期間每隔3分鐘搖動一次，保證抽提液與水稻植株細(xì)胞混合充分。取出離心管直至冷卻至室溫。③4℃，10000r／min離心10min，轉(zhuǎn)移上清至2mL的EP管中，加等體積（400mL）的平衡酚和氯仿：異戊醇(24:1)混勻。④4℃，10 000 r／min離心15 min，加入兩倍體積（800mL）的冰凍無水乙醇混勻，于20℃冰箱冷凍30min以上。⑤4℃，8 000 r／min離心10 min倒掉上清液。用800ul 70％乙醇洗滌，8 000r／min離心5min后倒掉上清，42℃風(fēng)干10min。與于50μl TE溶解，20℃儲存。運(yùn)用酸堿快速提取法根據(jù)詹慶才介紹的方法略作改進(jìn)：酸堿快抽法提取水稻基因組DNA，具體步驟如下：取1cm左右的水稻幼苗，加40μl DNA快抽溶液Ⅰ，100℃煮沸30s，然后加60μl緩沖液Ⅱ，100℃煮沸2min，待冷卻至室溫后用作PCR模板。 SSR分子標(biāo)記的PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化正交設(shè)計(jì)的PCR反應(yīng)體系優(yōu)化：反應(yīng)體系的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)材料為鹽兩優(yōu)2208，擴(kuò)增帶型單一的RM17為引物，對反應(yīng)體系中各個底物進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)針對DNA模板添加量、引物添加量、Buffer添加量、Taq 酶添加量、dNTPs添加量分寫設(shè)計(jì)4個添加量梯度，共16 個處理如表22，最后用ddH2O補(bǔ)至25μl。擴(kuò)增產(chǎn)物檢測采用濃度為3%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后3min，凝膠成像拍照。表22 正交設(shè)計(jì)的16組PCR反應(yīng)體系的各反應(yīng)底物添加量體系編號模板（μl）dNTP（μl）引物（μl）Taq酶（μl）Buffer（μl）1123124511617112819110111212132114215212162PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s，35個循環(huán)；最后一個循環(huán)72 ℃，延伸8 min，4 ℃保存。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳或者聚丙烯胺酰胺凝膠電泳檢測，用EB染色成像拍照并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測 瓊脂糖凝膠電泳1%的瓊脂糖凝膠電泳:，量取30ml 1TAE，用錫箔紙封住瓶口，微波爐加熱1min煮沸，待瓊脂糖全部融化。3%的瓊脂糖凝膠電泳:，量取30ml 1TAE，用錫箔紙封住瓶口，微波爐加熱2min煮沸，待瓊脂糖全部溶化，冷卻至65左右。預(yù)先將制膠板和膠槽洗干凈并晾干，將制膠板扣入膠槽，并插上梳子，將事先制好的煮好的瓊脂糖凝膠緩緩倒入制膠板，待凝膠均勻布滿整個制膠板，室溫凝固后，拔出梳子，將制膠板放入水平電泳槽，倒入1TAE直到電泳緩沖液沒過凝膠為止。點(diǎn)樣：將擴(kuò)增好的 PCR產(chǎn)物與6Loading Buffer以6:1的比例混勻，上樣4μl；電泳：恒壓100V，根據(jù)指示劑的位置，取出凝膠，EB染色3min，水槽沖洗，點(diǎn)樣孔也要沖洗干凈，凝膠成像拍照觀察。 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對田間鑒定的雜株進(jìn)行取樣，對應(yīng)取樣做SSR標(biāo)記分析，雜株類型分析采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺電泳具體過程如下：12%的非變膠的配制：在燒杯中依次加入30%、ddH2O 、60μl的加速劑TEMED和10%的（催化劑）過硫酸銨800μl并混勻；用移液槍開始向槽內(nèi)灌膠，當(dāng)膠液面升到玻璃板上沿時分，用夾子緊緊夾住膠，使丙烯酰胺至少聚合30min；電泳:等待凝膠完全聚合以后，取下夾子，TBE緩沖液充分浸泡玻璃板，在緩慢取出梳子，清理干凈點(diǎn)樣孔中的氣泡，用200V電壓預(yù)電泳8min。上樣：SSR引物擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物與DNA loddoing buffer按照3:1的比例混合，用10μL的微量移液器點(diǎn)樣4μl。恒電壓U=200V電泳,電泳時間以凝膠板上的藍(lán)色指示泳動至至膠版約四分之三處時停止電泳；凝膠染色：電泳結(jié)束后，倒干凈緩沖液，擰開垂直電泳槽，螺母，卸下電泳槽上的玻璃板。輕輕的移開兩塊玻璃板，使之分開，緩慢的將聚丙烯酰胺凝膠從玻璃板上剝離下來（切記不可讓膠破裂），用蒸餾水沖洗1min，將凝膠放入EB中染色，染色時間3min，染色完畢后用自來水漂洗干凈，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察和拍照 SSR引物的篩選本實(shí)驗(yàn)通過利用48的SSR引物（附表1）在雙親之間表現(xiàn)出的多態(tài)性，來篩選出在雙親前表現(xiàn)出多態(tài)性良好的引物，要求所篩選的引物盡可能滿足以下條件：SSR引物在雙親間的PCR產(chǎn)物電泳譜帶帶型單一、同一對引物在鹽兩優(yōu)220鹽恢88鹽220s三者相互之間都具有明顯的多態(tài)性。通過引物篩選我們可以找到供試品種的多態(tài)性引物，利用特征引物對種實(shí)驗(yàn)室浸種催芽隨機(jī)取樣的供試品種進(jìn)行SSR標(biāo)記的純度鑒定。對田間雜株取樣進(jìn)行SSR帶型分析。共顯性引物篩選：用48對SSR引物分別對鹽兩優(yōu)2208的親本進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出雙親之間具有共顯性、多態(tài)性的SSR引物。 SSR指紋圖譜譜帶分析對于任意一對SSR引物得到的指紋譜帶，利用成像儀上的軟件計(jì)算分子量，計(jì)算引物在所有樣品中的復(fù)等位位點(diǎn)數(shù)目，根據(jù)其分子量大小對所有復(fù)等位位點(diǎn)從小到大依次進(jìn)行阿拉伯?dāng)?shù)字編號。指紋圖譜上的條帶和軟件計(jì)算出的等位位點(diǎn)分子量大小相同的則用相同阿拉伯?dāng)?shù)字編號表示，同時參照聚丙烯酰胺電泳膠上的重復(fù)樣品，不同凝膠之間具有參照性，條帶賦值更精確。按此方法，獲得所有指紋圖譜條帶在聚丙烯酰胺凝膠上的多態(tài)性位置編號。成像儀軟件計(jì)算的條帶值是根據(jù)Marker條帶值估計(jì)出來的，可作為實(shí)驗(yàn)的參考值。 統(tǒng)計(jì)分析方法SSR標(biāo)記純度鑒定是，目前通常是取樣100或者200株提取DNA，從統(tǒng)計(jì)學(xué)的角度，為了保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確科學(xué)性以及SSR純度鑒定的效率，分析不同樣本量時的純度。為比較田間種植鑒定和SSR分子鑒定在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是否存在差異，分別記錄5對多態(tài)性的引物在檢測樣本數(shù)為100、200、300、400、500各個整百點(diǎn)時的純度，將5對引物之間的相同樣本數(shù)時的純度求平均值，對比調(diào)查孝感和海南田間1000株群體的純度，SSR分子標(biāo)記純度鑒定所需的最少樣本量，便可以滿足田間1000株取樣調(diào)查純度的要求。 純度計(jì)算方法通過田間表型鑒定與SSR標(biāo)記鑒定出各試驗(yàn)材料的純度，其計(jì)算公式如下：%鑒定總株數(shù)雜株數(shù)鑒定總株數(shù)純度= 田間雜株類型的分析為了檢測田間雜株中可能混有的異品種、變異品種，通過田間觀察鹽兩優(yōu)2208具體的表型，區(qū)分出不同的雜株類型，將田間鑒定出的雜株葉片分單株取樣分裝帶回實(shí)驗(yàn)室，對各個雜株進(jìn)行SSR分析，對比雙親條帶，如果通過瓊脂糖凝膠電泳無法區(qū)分出變異株和異品種，則進(jìn)一步采用分辨率更高的非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳。19第三章 結(jié)果與分析第三章 結(jié)果與分析 鹽兩優(yōu)2208田間雜株鑒定為了消除環(huán)境對水稻植株田間鑒定表現(xiàn)型的影響，降低試驗(yàn)誤差,更準(zhǔn)確地比較SSR分子鑒定與田間鑒定方法的差異,判斷用SSR鑒定代替田間鑒定的可行性與可靠性,并在海南和孝感2個環(huán)境中進(jìn)行。田間鑒定樣本為每重復(fù)1000株，鹽兩優(yōu)2208在海南和孝感兩地的田間檢測純度如31。表31 孝感和海南田間純度鑒定結(jié)果試驗(yàn)地 純度海南%孝感97%田間純度鑒定的鹽兩優(yōu)2208的總株數(shù)為1000，孝感檢測出的雜株數(shù)量為30株，純度為97%，海南檢測出的雜株數(shù)量為26株，純度為 %，具體結(jié)果如表32。從田間鑒定的結(jié)果可以看出，鹽兩優(yōu)2208在制種過程中操作嚴(yán)格，沒有父本混雜，且植株生長過程中母本自交結(jié)實(shí)的比重為6‰，證明了該品種的純度很高。表32 孝感田間雜株類型及數(shù)量父本母本變異株或異品種00662323 兩種方法提取模板DNA及對應(yīng)模板的PCR檢測對比“熱堿快抽法”和“SDS法”這兩種基因組DNA抽提法的效果（如圖31a）,分別將兩種方法提取的模板用SSR分子檢測，各自的檢測結(jié)果如圖（31b、31c、31d），比較發(fā)現(xiàn)，“SDS法”提取的模板DNA質(zhì)量明顯要優(yōu)于“熱堿快抽法”提取的模板DNA質(zhì)量，通過進(jìn)一步的SSR檢測發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入相同體積（）的模板時，“SDS法”的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量要高于“熱堿快抽法”的產(chǎn)物量，當(dāng)加大熱堿快抽法的模板添加量時，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量有明顯的增加，實(shí)驗(yàn)證明了通過增加（熱堿快抽法）的模板添加量時，可以用熱堿快抽法取代“SDS法”用于本實(shí)驗(yàn)的模板DNA的提取。圖31a 兩種方法提取的總DNA 注：M：EcoT14Ⅰdigest DNA m