分子克隆工具酶ppt課件(編輯修改稿)
2025-02-01 06:33 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 I。 ?不受影響 dcm甲基化酶在 5’ CCAGG3’或 5’ CCTGG3’序列中的胞嘧啶 C5位上引入甲基。 ?受其影響的酶有 EcoR II等哺乳動(dòng)物中的甲基化酶在 5’ CG3’序列中的 C5位上引入甲基。 (2) DNA樣品的甲基化程度 不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是 37℃ ，少數(shù)要求 40℃ ～ 65℃ 。 酶 最適溫度 ℃ 酶 最適溫度 ℃ Apa I Bcl I Mae II Taq I Apy I 30 50 50 65 30 BstE II Mae III Ban I Mae I Sma I 60 55 50 45 25 (3) 酶切消化反應(yīng)的溫度 ?緩沖液組分包括： 氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀、β 巰基乙醇或 DTT、 BSA、 TrisHCl等。 ?高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端 pH值等，會(huì)使一些限制酶的識(shí)別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的 Star activity現(xiàn)象。 ?每種酶只有在最適的反應(yīng)緩沖液中才具有最強(qiáng)的催化活性。 (4) 核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì) 大部分 II 型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應(yīng)條件 II 型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作 0～ 50 mM 低鹽酶； 100 mM 中鹽酶； 150 mM 高鹽酶 MgCl NaCl/KCl： 提供 Mg2+和離子強(qiáng)度； TrisHCl： 維持 pH； 二硫蘇糖醇（ DTT）：保持酶穩(wěn)定性； 牛血清白蛋白 BSA等：有助于酶的穩(wěn)定； 試劑 條件 試劑 條件 TrisHCl 50 mM pH DTT 1 mM MgCl2 10 mM Volume 20100 ml NaCl 0150 mM T t 37℃ h 對(duì)鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時(shí)酶切，對(duì)鹽濃度要求不同的酶， 可采取下列方法： 使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時(shí)酶解；低鹽酶先切，然后補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切；一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切。 Ⅱ 型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解 修復(fù)雙鏈 DNA上缺口處的磷酸二酯鍵。 DNA連接酶 OH P nick 5’… G CTCTGCA GGAG … 3’ 3’… C GAG ACGTCCTC … 5’ OH P nick DNA連接酶 5’… G CTCTGCAGGAG … 3’ 3’… C GAGACGTCCTC … 5’ ? 大腸桿菌 DNA連接酶 只能催化雙鏈 DNA的互補(bǔ)黏性末端，以NAD+為能量。 ? T4噬菌體連接酶 黏性、平末端均可連接，以 ATP為能量。 基本性質(zhì) DNA連接酶的連接作用 1）必須是兩條 雙鏈 DNA。 2） DNA3’端有游離的 OH， 5’端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（ P）。 3）需要 能量 動(dòng)物或噬菌體中： ATP 大腸桿菌中： NAD+ (1)連接條件 1 U DNA連接酶的酶活性： 在最佳反應(yīng)條件下15℃ 反應(yīng) 1 h，完全連接 1 mg lDNA（ Hind Ⅲ片段）所需的酶量。 試劑 條件 試劑 條件 TrisHCl 50～ 100 mM, pH DTT 5 mM MgCl2 10 mM Volume 10 20 ml ATP 1 mM T t 4 15 ℃ 4 16 h (2)DNA連接酶反應(yīng)條件 ? ATP（ NAD+)提供激活的 AMP。 ? ATP與連接酶形成共價(jià)“ 連接酶 AMP”復(fù)合物，并釋放出焦磷酸 PPi。 ? AMP與連接酶的 賴氨酸 ?氨基 相連。 OCCCH2CH2CH2CH2NH2+ +H3N AMP ATP PPi (3)連接反應(yīng)過程 “ 連接酶 AMP”復(fù)合物 ?AMP隨后從連接酶的賴氨酸 ?氨基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的 5’端 P上，形成 “ DNA腺苷酸 ” 復(fù)合物。 OH HOP AMP OH OP AMP DNA腺苷酸 ”復(fù)合物 ? 3’OH對(duì)磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出 AMP。 連接多個(gè)平頭雙鏈 DNA分子： 5’… G CTCAGCTGGAG … 3’ 3’… C GAGTCGACCTC … 5’ 5’… G CTCAGOH PCTGGAG … 3’ 3’… C GAGTCP OHGACCTC … 5’ T4DNA連接酶 T4 DNA連接酶 10～ 20倍。增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少載體自我連接的現(xiàn)象。 (1)插入片段與載體的濃度比例 (2)反應(yīng)溫度 ℃ ， 一般 14~16℃ 。 影響連接反應(yīng)的因素 DNA聚合酶 常用的聚合酶 ? 大腸桿菌 DNA聚合酶 ? Klenow fragment ? T7 DNA聚合酶 ? T4 DNA聚合酶 ? 修飾過的 T7 DNA聚合酶 ? 逆轉(zhuǎn)錄酶 催化以 DNA為模板合成 DNA的一類酶。 DNA聚合酶 3’?5’外切酶活性 5’?3’外切酶活性 聚合速率 持續(xù)能力 大腸桿菌 DNA聚合酶 低 有 中 低 Klenow fragment 低 無 中 低 T4DNA聚合酶 高 無 中 低 T7DNA聚合酶 高 無 快 高 化學(xué)修飾 T7DNA聚合酶 無 無 快 高 逆轉(zhuǎn)錄酶 無 無 低 中 Taq DNA聚合酶 無 有 快 高 常用 DNA聚合酶的特性比較 共同特點(diǎn) 把 dNTPs連續(xù)地加到引物的 3’OH端。 主要區(qū)別 持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。 T7 DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個(gè) dNTPs而不從模板上掉下來。 其它幾種聚合酶只能連續(xù)添加 10多個(gè) dNTPs就會(huì)從模板上解離下來。 常用的 DNA聚合酶的特點(diǎn) ?基本性質(zhì)： 5’ →3’的 DNA聚合酶活性 5’ →3’的核酸外切酶活性 3’ →5’的核酸外切酶活性 3’… G CTCAGCTGGAGA… 5’ 5’… C GAGTOH 5’ppp dNTP Mg2+ 3’… G CTCAGCTGGAGA… 5’ 5’… C
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