【文章內容簡介】 解最適 pH 值為 ； ②水解初期以內切酶作用為主，溶液粘度迅速下降； ③ N乙酰化度對其酶活性有影響，隨著脫乙?；潭鹊奶岣撸傅乃饣钚栽鰪?，以水溶性低聚殼聚糖為反應物時，酶的活性為最高； ④反應不遵循米氏方程 [19]，提高酶的質量分數(shù)或是底物的質量分數(shù)均可以提高反應速度； ⑤反應速度快，是生產寡糖的一條較好途徑。 Tom225。s 等 [20]用殼聚糖酶、纖維素酶、半纖維素酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶、阮酶、溶菌酶和脂肪酶分別水解殼聚糖 ,根據(jù)殼聚糖溶液粘度的減小和還原端的形成 ,發(fā)現(xiàn)纖維素酶、胃蛋白酶和脂肪酶尤其適合水解殼聚糖 ,其降解活性與殼聚糖酶相當。降解產物用高效液相色譜分離 ,發(fā)現(xiàn)用胃蛋白酶水解殼聚糖得到接近產率為 52%的低聚殼聚糖 ,而用其他酶水解不超過 46%。單一水解酶對殼聚糖降解程度有限，增加酶量也難以提高水解程度。若將非專一性水解酶按比例配合，利用酶之間水解作用的協(xié)同或互補效應可進一步提高對殼聚糖的水解程度。將 木瓜蛋白酶、果膠酶、纖維素酶以 ： ： (質量比 )配合成復合酶，在 pH值為 ，溫度為 40℃下水解 2h時，溶液粘度下降 %%。 糖基轉移法 糖基轉移法又稱酶法合成，是建立在酶反應基礎上，利用低聚合度寡糖在酶參與作用下，延長糖鏈成為高聚合度甲殼低聚糖。有關化學合成法研究在過去二十年取得較大進展，但合成過程涉及基團保護和基團脫去等過程，步驟較為復雜。而酶法合成則可在溫和條件下進行，且不需要進行羥基保護過程。糖基轉移反應受溫度、 pH、底物濃度和反應時間等因素影響，利用 糖基轉移反應合成低聚糖，不僅可調節(jié)聚合度，而且還可通過精心設計基質以合成特殊結構甲殼低聚糖衍生物。另外，將酶和超濾膜相結合制成膜過濾酶反應器，也可實現(xiàn)殼聚糖的連續(xù)生產。 其他方法 聯(lián)合降解法 異相體系中低分子量殼聚糖的制備 12 所謂聯(lián)合降解就是以上各種降解方法的組合使用，它的出現(xiàn)使低聚殼聚糖的制備進入了一個新的階段。 Wang 等在殼聚糖溶液中加入雙氧水，然后用低壓水銀燈發(fā)出的 254nm紫外光照射溶液 30min，發(fā)現(xiàn)紫外光對雙氧水降解殼聚糖具有協(xié)同作用。 Wu 等 [21]發(fā)現(xiàn)超聲波對臭氧降解殼聚糖具有協(xié)同作用?？梢?，隨著低聚 殼聚糖制備研究的深入，將會出現(xiàn)更多的、更實用的聯(lián)合降解工藝。 真菌降解法 除了用上述各種方法降解殼聚糖制備低聚殼聚糖外，也可以從真菌體中直接提取低聚殼聚糖。從真菌提取具有易操作、易控制、易制備高質量殼聚糖的優(yōu)點，而且在不同的環(huán)境和營養(yǎng)條件下用不同的菌株可以制備不同分子量的低聚殼聚糖，在提取過程中減少了由于使用酸堿所帶來的環(huán)境污染，是直接制備低聚殼聚糖的一種新的綠色工藝。 殼聚糖降解產物分析與表征方法 聚合度的測定 高效毛細管電泳具有高分辨率、高靈敏度及快速分離的特點，廣泛用于寡 糖的結構測定。將低分子量水溶性殼聚糖 50mg 加 150 μL 8氨基萘 1,3,6三磺酸鹽 (ANTS，溶于HAcH2O 中 )衍生物，并于 200 μL 1M NaBH3CN 絡合 (40℃ 水浴反應 15h)，使糖鏈帶負電荷，且具有發(fā)色團和熒光特性。由于大小不一的寡糖形成絡合物時，每個絡合物只帶一個電荷，這樣各種寡糖可根據(jù)分子大小在電泳中得到分離，并很快通過激光誘導熒光檢測，然后從出峰時間判斷寡糖的聚合度。通過峰面積計算各種聚合度的寡糖占總水解產物的百分比。 脫乙酰度的測定 測定殼聚糖的脫乙酰 度有很多方法，如化學分析方法（酸堿滴定法、電位滴定法、膠體滴定法、熱分解法、鹽酸鹽法等）或者儀器分析方法（紅外光譜法、近紅外光譜法、 1H核磁共振法、 1C 核磁共振法、紫外光譜法、紫外光譜的一階導數(shù)法、元素分析法、凝膠色譜法、高效液相色譜法、質譜法等），各種方法在樣品制備、分析時間、測定成本及精度上各有不同?；瘜W方法操作繁瑣、耗時較多，而儀器方法一般較昂貴。其中，酸堿滴定法（又稱堿量法）是經典的容量分析，具有操作簡單、適用范圍廣、儀器易得、處理周期短、數(shù)據(jù)易于處理等特點，被廣泛采用，很適合于生產過程的控制。該反 應的等當點約在 pH=左右。 相對分子質量的測定 可以采用凝膠滲透色譜法 (GPC)、蒸汽壓滲透計法、滲透壓法、端基法、黏度法、光散射法 (LS)和光散射 — 凝膠滲透色譜法 (GPCIS)等方法進行低聚殼聚糖分子量的測定。不同的測定方法得到的平均相對分子質量的意義不同：凝膠滲透色譜法測得的是重均相對分子質量和數(shù)均相對分子質量，光散射法測的是重均相對分子質量（ Mw） ，滲透壓法、蒸汽青島科技大學本科畢業(yè)設計（論文） 13 壓滲透計法和端基法測得的是數(shù)均相對分子質量 (Ma),黏度法只適合測定黏均相對分子質量 (Mv)，而且測定的相對分子質量的適用 范圍為 10000 以上。 高壓液相色譜法可測得絕對相對分子質量，同時還能得到相對分子質量分布圖，成為一種普遍采用的相對分子質量和相對分子質量分布測定方法。高效毛細管電泳具有高分辨率、高靈敏度及快速分離的特點，廣泛用于寡糖的結構測定。光散射法也是常用方法，但不能準確測量分子量小于 5000 的低聚糖的分散度和相對分子質量。端基法因其不需要特殊的儀器設備，并且操作方便，應用較為廣泛，但誤差較大。 薄層色譜分析 采用乙酸乙脂 :甲醇 :水 :氨水 =5:9:1: 混合液作為硅膠薄板展開劑時，可將不同聚合度的殼聚糖 寡糖很好地分開，且層析重現(xiàn)性高，糖殘基數(shù)目和 Rf 值具有很好的線性關系。 實驗表明 :含有 1~6 糖單位的殼聚糖寡糖在實驗所選定的展層系統(tǒng)中分離效果很好 :無拖尾，標準品中的 6 個糖都分離得很清楚，殼聚糖寡糖點呈棕黃色，分離點都呈圓形?？梢缘玫胶芎玫奶菃挝粩?shù)目和 Rf 值的線性對應關系。與高效液相色譜法 (HPLC)結合是一種可靠的殼聚糖寡糖分析方法。 紅外吸收光譜分析 將高分子殼聚糖和低分子殼聚糖 KBr 壓片， 400~4000cm1區(qū)間掃描，分子量不同的殼聚糖紅外光譜結構表征基本一致。幾個特征峰如 3450cm1 的 OH 伸縮吸收峰， 2567cm1的 CH 伸縮吸收峰， 1665cm1， 1550cm1的酰胺峰都存在。低分子量殼聚糖由于羥基的增多， 3450cm1處出現(xiàn)較強的 OH 吸收峰 [22]。在殼聚糖降解前后 3400cm1左右的 NH 伸縮振動、 1600cm1左右的 NH 彎曲振動等主要峰的位置都無變化，只是隨殼聚糖相對分子質量的降低各峰峰強有所變化，進一步證實了該協(xié)同反應是以開裂殼聚糖的 β(1,4)糖苷鍵來進行 [23]。說明降解前后殼聚糖糖環(huán)結構沒有改變。 異相體系中低分子量殼聚糖的制備 14 2. 異相體系中制備低分子量殼聚糖 黏度法測原料殼聚糖分子量 實驗原理 黏度反映了高聚物的相對分子質量大小，通過一定的方法測定出殼聚糖的黏度，就可以推測計算出其相對分子質量。黏度法分旋轉式黏度計測定黏度和烏氏黏度計測定特性黏度。工業(yè)上常采用旋轉黏度計快速測定指定濃度的黏度 (單位 :Pas)，用于估算或比較相對分子質量的大小，但不能準確知道殼聚糖的相對分子質量；用烏氏黏度計可以快速測定特性黏度，繼而得到黏均相對分子質量，而且，烏氏黏度計價廉易得。烏氏黏度計如圖 21所示： 圖 21:烏氏黏度計 : Ubbelohde viseter 用烏氏黏度計測定高聚物相對分子質量的原理如下： 黏性液體在流動過程中所受阻力的大小可用黏度系數(shù) η（簡稱黏度）來表示，高聚物溶液的黏度是高聚物分子間的內摩擦力、高聚物分子和溶劑分子間的內摩擦力以及溶劑分子間內摩擦力三者之和。定義增比黏度 ηsp： ηsp=(η η0 )/ η0 =ηr1 式中， η — 高聚物溶液的黏度 η0 錯誤 !未找到引用源。 — 純溶劑的黏度 ηr 錯誤 !未找到引用源。 — 相對黏度，為溶液黏度與純溶劑黏度的比值 定義高聚物的比濃黏度為 ηsp /c錯誤 !未找到引用源。 、 比濃對數(shù)黏度為 ln ηr/c ，特性黏度為 [η]錯誤 !未找到引用源。 。在足夠稀的高聚物溶液中， ηsp /c 和 c、 ln ηr/c 和 c 之間分別符合下述經驗關系式： ηsp /c=[η]+κ[η]2c ln ηr/c=[η]β[η]2c 青島科技大學本科畢業(yè)設計（論文） 15 式中， κ和 β是兩個常數(shù)。 這是兩個直線方程，通過 ηsp /c 錯誤 !未找到引用源。 對 c、 ln ηr/c 對 c 作圖，外推至 c→0 時所得的截距即為 [η]。對于同一高聚物，由上面兩個線性方程作圖外推所得截距應交于同一點，如圖 22 所示： 圖 22 ηsp /c c、 ln ηr/c– c ηsp /c c、 ln ηr/c – c 在一定的原料、溫度和溶劑等條件下，高聚物的特性黏度與相對分子質量之間的關系遵循下面的經驗公式，即 MarkHouwink 經驗式 ： [η]=KMα 式中， [η]— 特性粘度（與分子量、溫度、濃度、溶劑等因素有關） ,g/ml M— 相對分子質量 K— 常數(shù)（與體系性質關系不大單依賴于溫度） α— 常數(shù)（與相對分子質量有關，通 常 1＞ α＞ ） K、 α 由實驗來確定，先將高聚物盡可能按相對分子質量分級，然后測定各級的 [η]和平均相對分子質量 M(用其他測定絕對相對分子質量的方法測得 )，如果在實驗的相對分子質量范圍 α內是常數(shù)，則 lg[η]對 lgM 作圖得到一條直線，直線的斜率即為 α，截距即為 lgK；如果 α不是常數(shù)，則 lg[η]對 lgM 作圖得不到一條直線，只能求得在各段相對分子質量范圍內適用的 K 和 α。 王偉等 [24]以 mol/LCH3COONa+ mol/LCH3COOH 為溶劑，在 30℃ 下用光散射法定出不同脫乙酰度殼聚糖的 K 和 α值，結果顯示，殼聚糖的脫乙酰度越大， α越小，分子鏈的剛性越小，殼聚糖溶液的黏度越小。 已知液體在重力作用下流經烏氏粘度計的毛細管時遵守泊松定律，用同一只黏度計在相同條件下測定高聚物稀溶液 (c110kgm3)和純溶劑的黏度，溶液的密度和純溶劑的密度可近似看作相同，其相對黏度可以表示為： ηr =η/η0 = t/t0，式中， η、 η0分別為溶液和純溶劑的黏度， t 和 t0分別為溶液和純溶劑的流出時間。 實驗中，只要測出不同濃度下原料殼聚糖的相對黏度，即可求得 ηsp/c、 lgηr/c，作 ηsp /c異相體系中低分子量殼聚糖的制備 16 對 c 及 lgηr/c 對 c 的關系圖，外推至 c→0 ,求得 [η],在已知 K 和 α條件下即可計算出原料殼聚糖的相對分子質量。 另外，由于用黏度法測定高聚物分子量的 ηr為 ，據(jù)此，測定殼聚糖的黏均分子量，在 25℃下其最適宜的濃度范圍是 103g/ml，若當初始濃度高于上限時， ηr值大于 ， 使 lgηr/c 對 c 的實驗曲線向上彎曲，影響外推值；當濃度低于下限時，溶液與溶劑的流出時間非常接近，會產生較大的系統(tǒng)誤差。由此，結合對稱量精度的考慮，經過多次預實驗，我們確定殼聚糖溶液的初始濃度為 103g/ml。 材料與儀器 （ 1） 實驗材料：殼聚糖（ 生化試劑， 濟南海得貝生物制藥 ）；冰醋酸（分析純，天津恒興化學試劑制造有限公司）；氯化鈉（分析純，天津登科化學試劑有限公司）；蒸餾水 （ 2）實驗儀器： 分析天平（型號 EL204，梅特勒 托利多儀器有限公司）；烏氏粘度計（內徑 ~，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司）；玻璃恒溫水??；循環(huán)水式多用真空泵；多頭磁力攪拌器；秒表；洗耳球；保鮮膜；玻璃砂芯漏斗 1 個； 250mL、 500mL容量瓶各 1 個； 500mL 抽濾瓶 1 個； 10mL 移液管 2 支； 2mL 移液管 1 支； 100mL、 200mL燒杯各 1 只 實驗方法 （ 1） （殼聚糖溶劑）的配制： 精確稱取 固體，加適量蒸餾水溶于 100mL 燒杯中，移液管量取 冰醋酸溶于燒杯中；將燒杯中溶液移入 500mL 容量瓶，用蒸餾水洗滌燒杯 3 次，洗滌液移入容量瓶；用蒸餾水定容至刻度線，搖勻，備用。 （ 2） %殼聚糖溶液的配制： ①準確稱量 殼聚糖于燒杯中 ，加適量 NaCl HAc 溶液，放入磁子，用保鮮膜封住杯口，磁力攪拌至殼聚糖溶解。 ②將溶解過后的殼聚糖溶液移入 250mL 容量瓶中，用 NaCl HAc 溶液洗滌燒杯 3 次，洗液移入容量瓶；用 NaCl HAc 溶液定容至刻度線、搖勻。 ③將殼聚糖溶液用玻璃砂芯漏斗過濾（防止不溶性顆粒堵住烏氏黏度計的毛細管），取濾液待用。 （ 3）烏氏黏度計測分子量 ①將玻璃恒溫水浴調節(jié)至 ℃ ，在黏度計的 B、 C 兩管上分別裝上乳膠管。將黏度計垂直安裝在鐵架臺上并放入恒溫水浴中，水面浸沒 G 球。 ② 用移液管吸取 11mL 殼聚糖溶液，濃度記為 c1，由 A 口加入到干燥的黏度計中，恒溫 15min。 ③用夾子夾住 C 管口的乳膠管，使 C 管不通氣，用洗耳球從 B 管處將溶液吸到 G 球的中部，然后將 C、 B 管放開，使溶液下落，準確記下溶液由 a 刻度落到 b 刻度時的時間 。重