【文章內(nèi)容簡介】 解最適 pH 值為 ； ②水解初期以內(nèi)切酶作用為主，溶液粘度迅速下降； ③ N乙?；葘?duì)其酶活性有影響，隨著脫乙?；潭鹊奶岣撸傅乃饣钚栽鰪?qiáng)，以水溶性低聚殼聚糖為反應(yīng)物時(shí)，酶的活性為最高； ④反應(yīng)不遵循米氏方程 [19]，提高酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)或是底物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均可以提高反應(yīng)速度； ⑤反應(yīng)速度快，是生產(chǎn)寡糖的一條較好途徑。 Tom225。s 等 [20]用殼聚糖酶、纖維素酶、半纖維素酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶、阮酶、溶菌酶和脂肪酶分別水解殼聚糖 ,根據(jù)殼聚糖溶液粘度的減小和還原端的形成 ,發(fā)現(xiàn)纖維素酶、胃蛋白酶和脂肪酶尤其適合水解殼聚糖 ,其降解活性與殼聚糖酶相當(dāng)。降解產(chǎn)物用高效液相色譜分離 ,發(fā)現(xiàn)用胃蛋白酶水解殼聚糖得到接近產(chǎn)率為 52%的低聚殼聚糖 ,而用其他酶水解不超過 46%。單一水解酶對(duì)殼聚糖降解程度有限，增加酶量也難以提高水解程度。若將非專一性水解酶按比例配合，利用酶之間水解作用的協(xié)同或互補(bǔ)效應(yīng)可進(jìn)一步提高對(duì)殼聚糖的水解程度。將 木瓜蛋白酶、果膠酶、纖維素酶以 ： ： (質(zhì)量比 )配合成復(fù)合酶，在 pH值為 ，溫度為 40℃下水解 2h時(shí)，溶液粘度下降 %%。 糖基轉(zhuǎn)移法 糖基轉(zhuǎn)移法又稱酶法合成，是建立在酶反應(yīng)基礎(chǔ)上，利用低聚合度寡糖在酶參與作用下，延長糖鏈成為高聚合度甲殼低聚糖。有關(guān)化學(xué)合成法研究在過去二十年取得較大進(jìn)展，但合成過程涉及基團(tuán)保護(hù)和基團(tuán)脫去等過程，步驟較為復(fù)雜。而酶法合成則可在溫和條件下進(jìn)行，且不需要進(jìn)行羥基保護(hù)過程。糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)受溫度、 pH、底物濃度和反應(yīng)時(shí)間等因素影響，利用 糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)合成低聚糖，不僅可調(diào)節(jié)聚合度，而且還可通過精心設(shè)計(jì)基質(zhì)以合成特殊結(jié)構(gòu)甲殼低聚糖衍生物。另外，將酶和超濾膜相結(jié)合制成膜過濾酶反應(yīng)器，也可實(shí)現(xiàn)殼聚糖的連續(xù)生產(chǎn)。 其他方法 聯(lián)合降解法 異相體系中低分子量殼聚糖的制備 12 所謂聯(lián)合降解就是以上各種降解方法的組合使用，它的出現(xiàn)使低聚殼聚糖的制備進(jìn)入了一個(gè)新的階段。 Wang 等在殼聚糖溶液中加入雙氧水，然后用低壓水銀燈發(fā)出的 254nm紫外光照射溶液 30min，發(fā)現(xiàn)紫外光對(duì)雙氧水降解殼聚糖具有協(xié)同作用。 Wu 等 [21]發(fā)現(xiàn)超聲波對(duì)臭氧降解殼聚糖具有協(xié)同作用?？梢?，隨著低聚 殼聚糖制備研究的深入，將會(huì)出現(xiàn)更多的、更實(shí)用的聯(lián)合降解工藝。 真菌降解法 除了用上述各種方法降解殼聚糖制備低聚殼聚糖外，也可以從真菌體中直接提取低聚殼聚糖。從真菌提取具有易操作、易控制、易制備高質(zhì)量殼聚糖的優(yōu)點(diǎn)，而且在不同的環(huán)境和營養(yǎng)條件下用不同的菌株可以制備不同分子量的低聚殼聚糖，在提取過程中減少了由于使用酸堿所帶來的環(huán)境污染，是直接制備低聚殼聚糖的一種新的綠色工藝。 殼聚糖降解產(chǎn)物分析與表征方法 聚合度的測(cè)定 高效毛細(xì)管電泳具有高分辨率、高靈敏度及快速分離的特點(diǎn)，廣泛用于寡 糖的結(jié)構(gòu)測(cè)定。將低分子量水溶性殼聚糖 50mg 加 150 μL 8氨基萘 1,3,6三磺酸鹽 (ANTS，溶于HAcH2O 中 )衍生物，并于 200 μL 1M NaBH3CN 絡(luò)合 (40℃ 水浴反應(yīng) 15h)，使糖鏈帶負(fù)電荷，且具有發(fā)色團(tuán)和熒光特性。由于大小不一的寡糖形成絡(luò)合物時(shí)，每個(gè)絡(luò)合物只帶一個(gè)電荷，這樣各種寡糖可根據(jù)分子大小在電泳中得到分離，并很快通過激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)，然后從出峰時(shí)間判斷寡糖的聚合度。通過峰面積計(jì)算各種聚合度的寡糖占總水解產(chǎn)物的百分比。 脫乙酰度的測(cè)定 測(cè)定殼聚糖的脫乙酰 度有很多方法，如化學(xué)分析方法（酸堿滴定法、電位滴定法、膠體滴定法、熱分解法、鹽酸鹽法等）或者儀器分析方法（紅外光譜法、近紅外光譜法、 1H核磁共振法、 1C 核磁共振法、紫外光譜法、紫外光譜的一階導(dǎo)數(shù)法、元素分析法、凝膠色譜法、高效液相色譜法、質(zhì)譜法等），各種方法在樣品制備、分析時(shí)間、測(cè)定成本及精度上各有不同?；瘜W(xué)方法操作繁瑣、耗時(shí)較多，而儀器方法一般較昂貴。其中，酸堿滴定法（又稱堿量法）是經(jīng)典的容量分析，具有操作簡單、適用范圍廣、儀器易得、處理周期短、數(shù)據(jù)易于處理等特點(diǎn)，被廣泛采用，很適合于生產(chǎn)過程的控制。該反 應(yīng)的等當(dāng)點(diǎn)約在 pH=左右。 相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定 可以采用凝膠滲透色譜法 (GPC)、蒸汽壓滲透計(jì)法、滲透壓法、端基法、黏度法、光散射法 (LS)和光散射 — 凝膠滲透色譜法 (GPCIS)等方法進(jìn)行低聚殼聚糖分子量的測(cè)定。不同的測(cè)定方法得到的平均相對(duì)分子質(zhì)量的意義不同：凝膠滲透色譜法測(cè)得的是重均相對(duì)分子質(zhì)量和數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量，光散射法測(cè)的是重均相對(duì)分子質(zhì)量（ Mw） ，滲透壓法、蒸汽青島科技大學(xué)本科畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 13 壓滲透計(jì)法和端基法測(cè)得的是數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量 (Ma),黏度法只適合測(cè)定黏均相對(duì)分子質(zhì)量 (Mv)，而且測(cè)定的相對(duì)分子質(zhì)量的適用 范圍為 10000 以上。 高壓液相色譜法可測(cè)得絕對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量，同時(shí)還能得到相對(duì)分子質(zhì)量分布圖，成為一種普遍采用的相對(duì)分子質(zhì)量和相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)定方法。高效毛細(xì)管電泳具有高分辨率、高靈敏度及快速分離的特點(diǎn)，廣泛用于寡糖的結(jié)構(gòu)測(cè)定。光散射法也是常用方法，但不能準(zhǔn)確測(cè)量分子量小于 5000 的低聚糖的分散度和相對(duì)分子質(zhì)量。端基法因其不需要特殊的儀器設(shè)備，并且操作方便，應(yīng)用較為廣泛，但誤差較大。 薄層色譜分析 采用乙酸乙脂 :甲醇 :水 :氨水 =5:9:1: 混合液作為硅膠薄板展開劑時(shí)，可將不同聚合度的殼聚糖 寡糖很好地分開，且層析重現(xiàn)性高，糖殘基數(shù)目和 Rf 值具有很好的線性關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)表明 :含有 1~6 糖單位的殼聚糖寡糖在實(shí)驗(yàn)所選定的展層系統(tǒng)中分離效果很好 :無拖尾，標(biāo)準(zhǔn)品中的 6 個(gè)糖都分離得很清楚，殼聚糖寡糖點(diǎn)呈棕黃色，分離點(diǎn)都呈圓形?？梢缘玫胶芎玫奶菃挝粩?shù)目和 Rf 值的線性對(duì)應(yīng)關(guān)系。與高效液相色譜法 (HPLC)結(jié)合是一種可靠的殼聚糖寡糖分析方法。 紅外吸收光譜分析 將高分子殼聚糖和低分子殼聚糖 KBr 壓片， 400~4000cm1區(qū)間掃描，分子量不同的殼聚糖紅外光譜結(jié)構(gòu)表征基本一致。幾個(gè)特征峰如 3450cm1 的 OH 伸縮吸收峰， 2567cm1的 CH 伸縮吸收峰， 1665cm1， 1550cm1的酰胺峰都存在。低分子量殼聚糖由于羥基的增多， 3450cm1處出現(xiàn)較強(qiáng)的 OH 吸收峰 [22]。在殼聚糖降解前后 3400cm1左右的 NH 伸縮振動(dòng)、 1600cm1左右的 NH 彎曲振動(dòng)等主要峰的位置都無變化，只是隨殼聚糖相對(duì)分子質(zhì)量的降低各峰峰強(qiáng)有所變化，進(jìn)一步證實(shí)了該協(xié)同反應(yīng)是以開裂殼聚糖的 β(1,4)糖苷鍵來進(jìn)行 [23]。說明降解前后殼聚糖糖環(huán)結(jié)構(gòu)沒有改變。 異相體系中低分子量殼聚糖的制備 14 2. 異相體系中制備低分子量殼聚糖 黏度法測(cè)原料殼聚糖分子量 實(shí)驗(yàn)原理 黏度反映了高聚物的相對(duì)分子質(zhì)量大小，通過一定的方法測(cè)定出殼聚糖的黏度，就可以推測(cè)計(jì)算出其相對(duì)分子質(zhì)量。黏度法分旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)測(cè)定黏度和烏氏黏度計(jì)測(cè)定特性黏度。工業(yè)上常采用旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)快速測(cè)定指定濃度的黏度 (單位 :Pas)，用于估算或比較相對(duì)分子質(zhì)量的大小，但不能準(zhǔn)確知道殼聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量；用烏氏黏度計(jì)可以快速測(cè)定特性黏度，繼而得到黏均相對(duì)分子質(zhì)量，而且，烏氏黏度計(jì)價(jià)廉易得。烏氏黏度計(jì)如圖 21所示： 圖 21:烏氏黏度計(jì) : Ubbelohde viseter 用烏氏黏度計(jì)測(cè)定高聚物相對(duì)分子質(zhì)量的原理如下： 黏性液體在流動(dòng)過程中所受阻力的大小可用黏度系數(shù) η（簡稱黏度）來表示，高聚物溶液的黏度是高聚物分子間的內(nèi)摩擦力、高聚物分子和溶劑分子間的內(nèi)摩擦力以及溶劑分子間內(nèi)摩擦力三者之和。定義增比黏度 ηsp： ηsp=(η η0 )/ η0 =ηr1 式中， η — 高聚物溶液的黏度 η0 錯(cuò)誤 !未找到引用源。 — 純?nèi)軇┑酿ざ? ηr 錯(cuò)誤 !未找到引用源。 — 相對(duì)黏度，為溶液黏度與純?nèi)軇ざ鹊谋戎? 定義高聚物的比濃黏度為 ηsp /c錯(cuò)誤 !未找到引用源。 、 比濃對(duì)數(shù)黏度為 ln ηr/c ，特性黏度為 [η]錯(cuò)誤 !未找到引用源。 。在足夠稀的高聚物溶液中， ηsp /c 和 c、 ln ηr/c 和 c 之間分別符合下述經(jīng)驗(yàn)關(guān)系式： ηsp /c=[η]+κ[η]2c ln ηr/c=[η]β[η]2c 青島科技大學(xué)本科畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 15 式中， κ和 β是兩個(gè)常數(shù)。 這是兩個(gè)直線方程，通過 ηsp /c 錯(cuò)誤 !未找到引用源。 對(duì) c、 ln ηr/c 對(duì) c 作圖，外推至 c→0 時(shí)所得的截距即為 [η]。對(duì)于同一高聚物，由上面兩個(gè)線性方程作圖外推所得截距應(yīng)交于同一點(diǎn)，如圖 22 所示： 圖 22 ηsp /c c、 ln ηr/c– c ηsp /c c、 ln ηr/c – c 在一定的原料、溫度和溶劑等條件下，高聚物的特性黏度與相對(duì)分子質(zhì)量之間的關(guān)系遵循下面的經(jīng)驗(yàn)公式，即 MarkHouwink 經(jīng)驗(yàn)式 ： [η]=KMα 式中， [η]— 特性粘度（與分子量、溫度、濃度、溶劑等因素有關(guān)） ,g/ml M— 相對(duì)分子質(zhì)量 K— 常數(shù)（與體系性質(zhì)關(guān)系不大單依賴于溫度） α— 常數(shù)（與相對(duì)分子質(zhì)量有關(guān)，通 常 1＞ α＞ ） K、 α 由實(shí)驗(yàn)來確定，先將高聚物盡可能按相對(duì)分子質(zhì)量分級(jí)，然后測(cè)定各級(jí)的 [η]和平均相對(duì)分子質(zhì)量 M(用其他測(cè)定絕對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量的方法測(cè)得 )，如果在實(shí)驗(yàn)的相對(duì)分子質(zhì)量范圍 α內(nèi)是常數(shù)，則 lg[η]對(duì) lgM 作圖得到一條直線，直線的斜率即為 α，截距即為 lgK；如果 α不是常數(shù)，則 lg[η]對(duì) lgM 作圖得不到一條直線，只能求得在各段相對(duì)分子質(zhì)量范圍內(nèi)適用的 K 和 α。 王偉等 [24]以 mol/LCH3COONa+ mol/LCH3COOH 為溶劑，在 30℃ 下用光散射法定出不同脫乙酰度殼聚糖的 K 和 α值，結(jié)果顯示，殼聚糖的脫乙酰度越大， α越小，分子鏈的剛性越小，殼聚糖溶液的黏度越小。 已知液體在重力作用下流經(jīng)烏氏粘度計(jì)的毛細(xì)管時(shí)遵守泊松定律，用同一只黏度計(jì)在相同條件下測(cè)定高聚物稀溶液 (c110kgm3)和純?nèi)軇┑酿ざ?，溶液的密度和純?nèi)軇┑拿芏瓤山瓶醋飨嗤?，其相?duì)黏度可以表示為： ηr =η/η0 = t/t0，式中， η、 η0分別為溶液和純?nèi)軇┑酿ざ龋?t 和 t0分別為溶液和純?nèi)軇┑牧鞒鰰r(shí)間。 實(shí)驗(yàn)中，只要測(cè)出不同濃度下原料殼聚糖的相對(duì)黏度，即可求得 ηsp/c、 lgηr/c，作 ηsp /c異相體系中低分子量殼聚糖的制備 16 對(duì) c 及 lgηr/c 對(duì) c 的關(guān)系圖，外推至 c→0 ,求得 [η],在已知 K 和 α條件下即可計(jì)算出原料殼聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量。 另外，由于用黏度法測(cè)定高聚物分子量的 ηr為 ，據(jù)此，測(cè)定殼聚糖的黏均分子量，在 25℃下其最適宜的濃度范圍是 103g/ml，若當(dāng)初始濃度高于上限時(shí)， ηr值大于 ， 使 lgηr/c 對(duì) c 的實(shí)驗(yàn)曲線向上彎曲，影響外推值；當(dāng)濃度低于下限時(shí)，溶液與溶劑的流出時(shí)間非常接近，會(huì)產(chǎn)生較大的系統(tǒng)誤差。由此，結(jié)合對(duì)稱量精度的考慮，經(jīng)過多次預(yù)實(shí)驗(yàn)，我們確定殼聚糖溶液的初始濃度為 103g/ml。 材料與儀器 （ 1） 實(shí)驗(yàn)材料：殼聚糖（ 生化試劑， 濟(jì)南海得貝生物制藥 ）；冰醋酸（分析純，天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司）；氯化鈉（分析純，天津登科化學(xué)試劑有限公司）；蒸餾水 （ 2）實(shí)驗(yàn)儀器： 分析天平（型號(hào) EL204，梅特勒 托利多儀器有限公司）；烏氏粘度計(jì)（內(nèi)徑 ~，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司）；玻璃恒溫水?。谎h(huán)水式多用真空泵；多頭磁力攪拌器；秒表；洗耳球；保鮮膜；玻璃砂芯漏斗 1 個(gè)； 250mL、 500mL容量瓶各 1 個(gè)； 500mL 抽濾瓶 1 個(gè)； 10mL 移液管 2 支； 2mL 移液管 1 支； 100mL、 200mL燒杯各 1 只 實(shí)驗(yàn)方法 （ 1） （殼聚糖溶劑）的配制： 精確稱取 固體，加適量蒸餾水溶于 100mL 燒杯中，移液管量取 冰醋酸溶于燒杯中；將燒杯中溶液移入 500mL 容量瓶，用蒸餾水洗滌燒杯 3 次，洗滌液移入容量瓶；用蒸餾水定容至刻度線，搖勻，備用。 （ 2） %殼聚糖溶液的配制： ①準(zhǔn)確稱量 殼聚糖于燒杯中 ，加適量 NaCl HAc 溶液，放入磁子，用保鮮膜封住杯口，磁力攪拌至殼聚糖溶解。 ②將溶解過后的殼聚糖溶液移入 250mL 容量瓶中，用 NaCl HAc 溶液洗滌燒杯 3 次，洗液移入容量瓶；用 NaCl HAc 溶液定容至刻度線、搖勻。 ③將殼聚糖溶液用玻璃砂芯漏斗過濾（防止不溶性顆粒堵住烏氏黏度計(jì)的毛細(xì)管），取濾液待用。 （ 3）烏氏黏度計(jì)測(cè)分子量 ①將玻璃恒溫水浴調(diào)節(jié)至 ℃ ，在黏度計(jì)的 B、 C 兩管上分別裝上乳膠管。將黏度計(jì)垂直安裝在鐵架臺(tái)上并放入恒溫水浴中，水面浸沒 G 球。 ② 用移液管吸取 11mL 殼聚糖溶液，濃度記為 c1，由 A 口加入到干燥的黏度計(jì)中，恒溫 15min。 ③用夾子夾住 C 管口的乳膠管，使 C 管不通氣，用洗耳球從 B 管處將溶液吸到 G 球的中部，然后將 C、 B 管放開，使溶液下落，準(zhǔn)確記下溶液由 a 刻度落到 b 刻度時(shí)的時(shí)間 。重