【文章內(nèi)容簡介】 NOOH 3 CH 3 CC H 3荷 葉 堿NH 3 COH OC H 3荷 葉 堿 G 1D M FN a B H 4 , P h c h 2 S e G2 使用乙氰 、三溴化鋁 對荷葉堿 G1進行進一步改造，將其 2 位甲氧基消解為羥基， 的荷葉堿 G2。 NOH OH 3 CC H 3荷 葉 堿 G 1NH OH O C H 3荷 葉 堿 G 2C H 3 C NA l B r 3 二、材料與方法 （一）、材料和儀器 藥材 荷葉 （ 購自蘭州安寧醫(yī)藥公司復興厚藥莊，由蘭州理工大學楊林副教授鑒定。） 蘭州理工大學生命科學與工程學院畢業(yè)論文 8 試劑 工業(yè)乙醇 氯仿（分析純） 濃鹽酸（分析純） 濃氨水（分析純） 氫氧化鈉（分析純） 濃鹽酸（分析純） 濃硫酸 硼氫化鈉 乙氰 (分析純 ) 二芐基二硒 三溴化鋁 柱層析硅膠 GF254薄層硅膠 儀器 HH2數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司） ZF7型三用紫外分析儀（上海金達生化儀器有限公司） RE5286A型旋轉蒸發(fā)儀 (上海亞榮生化儀器廠 ) SHBIIIA循環(huán)水式多用真空泵（保定高薪區(qū)陽光科教儀器廠） KQ250DE型數(shù)控超聲波清洗器（ 40KHz，80W，） DL3005低溫循環(huán)水?。ńK金壇市醫(yī)療器械廠） 冰箱 移液槍（ 200?L， 1000?L） 分析天平 容量瓶 冷凝管 燒杯（ 500mL）玻璃棒 玻璃柱 圓底燒瓶（ 1000 mL， 500mL， 100,5L）三口圓底燒瓶（ 100ml， 50ml） 分液漏斗（ 3000 mL， 100ml）布氏漏斗 抽慮瓶 電吹風 (二 )、試驗方法 生物堿提取過程 (1) 藥材預處理 將藥材用粉碎機粉碎（在粉碎藥材前要將粉碎機清理干凈，避免上種藥材混入，造成實驗誤差） （ 2）生物堿提取 稱取荷葉粉 沫 500g加入到 5L的大圓底燒瓶中，按照質(zhì)體比 1:7加入 3500ml工業(yè)乙醇，85℃水浴加熱回流兩次，每次 2h，抽濾并合并回流液。 將抽濾液分批加入 1000ml圓底燒瓶減壓蒸餾，濃縮至粘稠浸膏。 在浸膏中加入約 600ml水溶解，使用 2mol/L的 HCL將 PH調(diào) 至 23，充分攪拌并靜止過夜。對過夜后的溶解液進行抽濾，濾液使用 2mol/L NaOH將 PH調(diào)至 1011，將溶液轉入分液漏斗中使用 氯仿萃取 4次，每次氯仿 700ml，減壓蒸餾氯仿。既得荷葉總堿。 實驗現(xiàn)象：所得荷葉醇提物為深深的磚紅色，經(jīng)濃縮后獲得大量黑色浸膏，此浸膏在加入水后并不溶解，此時水中顯淡淡的磚紅色，在調(diào) PH至 23后，水的顏色有加深，考慮到浸膏太過粘稠并不溶于水，所以使用玻璃棒對其進行了充分的攪拌， 此時水溶液的顏色已變?yōu)檩^深的磚紅色。在抽濾后的酸性溶液中加入 NaOH調(diào)堿時，在 PH 調(diào)至 56時 溶液開始出現(xiàn)大量磚紅色絮狀沉淀，繼續(xù)加 NaOH 后絮狀沉淀繼續(xù)增加，在 PH調(diào)至 9后，絮狀沉淀的 增 加減少。在萃取時 ，氯仿溶液顯淺綠紅色。 （ 1）樣品的預處理及裝柱 根據(jù)資料得知荷葉總堿有四 種 主要成分， 其中 荷葉堿含量最高，既為薄層板上的最主點。將所得的荷葉堿 點準備上樣與薄層硅膠色譜柱上進行分離， 點 總樣于 4*8 的小型號 GF254 薄層板硅膠板上 ， 使用氯甲比為 1:1混合液為展開劑，展開， 所點樣品主點 Rf值大于 ,并且樣品混合未得到分離 。重新點樣，使用氯甲比為 10:1混合 液展開， 所點樣品主點 分離 任然較模糊， 使用 氯甲比為 35:1混合液展開， 展開結果 顯示較好。 荷葉堿的展開主點 Rf值約為 由此確定使用氯甲比為 35:1的混合液為洗脫劑。 將所得的荷葉總堿稱取 （ ） ，使用少許氯仿溶解（約 3ml）轉移至小型蒸發(fā)皿，稱取 ，將硅膠加入蒸發(fā)皿中的氯仿溶解液中，適當攪拌溶液， 將蒸發(fā)皿靜止與通風廚下，待其 揮干。稱取薄層色譜柱硅膠 70g，置于 250ml燒杯中，使用氯甲比為 40:1的洗脫液溶解并攪拌至懸濁液，玻璃棒引流裝入 中型 玻璃柱中，靜止待其沉降， 打開玻 璃柱活塞，適量的放出少許溶劑至溶液上端略高于硅膠層 2cm 時關閉活塞。將蒸發(fā)皿中已揮干了溶劑的的硅膠使用研磨棒研細，并使用漏斗加入玻璃柱中，盡量保持硅膠曾的平整，使用少許蘭州理工大學生命科學與工程學院畢業(yè)論文 9 洗脫劑沖洗漏斗及玻璃柱壁中所粘的硅膠粉末。再稱取 作為最上層的 覆蓋 。 （ 2）樣品的洗脫 加入足量洗脫劑于柱中（剛開始需用吸管緩加，以免 將 硅膠被沖起）， 使用 100ml 錐形瓶 接收 洗脫液， 開始沖柱 ，每次洗脫液接受至 70ml左右換接受 瓶 ，并將所接受的洗脫液移入200ml圓底燒瓶 中 進行減壓 蒸干 ， 再使用少許氯仿（約 1ml）溶解并移入小青霉素瓶中，再次使用少許氯仿（約 1ml）沖洗燒瓶兩次，將沖洗液移入同一個青霉素瓶中，并對所對應的青霉素瓶進行標簽編號 (共約 45 瓶 ，在沖至三十瓶左右時所得沖洗液中所含有效成份太少，所以改用氯甲比為 30:1洗脫液沖洗 )。 （ 3）樣品的點樣粗分離 對上步所得的青霉素瓶中的溶液從第一瓶開始點樣于 GF254 硅膠 2*5 薄層板上， 每 瓶對應一個點， 每板 點三個樣品 點及 一個荷葉堿對照點，使用氯甲比為 20:1為展開劑 依次進行展開 ，將所得的薄層板使用電吹風吹干，于 254 熒光燈下觀察結果。結果顯示所得樣品整體可分為 5部分既瓶 3— 5:； 6— 9； 10— 19； 21— 29； 30— 45，根據(jù)對照判斷大體得知 8號為較純荷葉堿， 35主組份相似， 69主組份為荷葉堿， 1019主組份相似， 2029主組份相似， 3045主組份相似。 將成份相似的各組分合并，并依次標好標簽，得五瓶樣品液，靜止于通風廚中待其揮干。 （ 1）樣品的預處理及裝柱 將 上步 所得的荷葉堿主成份樣品稱重， 得 ，使用約 1ml 氯仿溶解并 點樣于 GF254硅膠 4*8薄層板上，使用氯甲比為 20:1展開劑進行展開，結果顯示混合樣品略微展開，再使用氯 甲比為 20:1的展開劑嘗試展開，結果顯示混合樣品有較好的分離，所以決定使用氯甲比為 20:1溶解為洗脫劑。 將樣品溶液 轉移至 小型蒸發(fā)皿中，稱取 1g柱層析硅膠，加入蒸發(fā)皿中混合并攪拌， 將蒸發(fā)皿靜止與通風廚下，待其揮干。稱取薄層色譜柱硅膠 45g，置于 250ml 燒杯中，使用氯甲比為 20:1的洗脫液溶解并攪拌至懸濁液，玻璃棒引流裝入小型玻璃柱中，靜止待其沉降，打開玻璃柱活塞，適量的放出少許溶劑至溶液上端略高于硅膠層 2cm 時關閉活塞。將蒸發(fā)皿中已揮干了溶劑的的硅膠使用研磨棒研細，并使用漏斗加入玻璃柱中，盡量保持硅 膠曾的平整，使用少許洗脫劑沖洗漏斗及玻璃柱壁中所粘的硅膠粉末。再稱取 柱中作為最上層的覆蓋。 （ 2）樣品的洗脫 加入足量洗脫劑于柱中，使用 100ml 錐形瓶接收洗脫液，開始沖柱，每次洗脫液接受至50ml左右換接受瓶，并將所接受的洗脫液移入 200ml 圓底燒瓶中進行減壓蒸干，再使用少許氯仿（約 1ml）溶解并移入小青霉素瓶中，再次使用少許氯仿（約 1ml）沖洗燒瓶兩次，將沖洗液移入同一個青霉素瓶中，并對所對應的青霉素瓶進行標簽編號 ，共 28 瓶 。 （ 3）樣品的點樣粗分離 對上步所得的青霉素瓶中的 溶液從第一瓶開始點樣于 GF254 硅膠 4*8 薄層板上，每瓶對應一個點，每板點三個樣品點及一個荷葉堿對照點，使用氯甲比為 10:1為展開劑依次進行展開，將所得的薄層板使用電吹風吹干，于 254 熒光燈下觀察結果。結果顯示所得樣品整體可分為 3 部分既瓶 3— 7:； 7— 16； 1728，根據(jù)對照判斷大體得知 716 號為荷葉堿。將 716號瓶樣品合并，并置于通風廚下?lián)]干，得純度較高荷葉堿。 3 荷葉堿的結構改造 1位脫甲氧基 蘭州理工大學生命科學與工程學院畢業(yè)論文 10 （ 1）反應制備荷葉堿 G1 取三口圓底燒瓶一個， 將其架于油浴上， 使用磨口塞塞住左口，橡皮塞塞住右口（目的是下步注入反應劑及催化劑），使用磨口旋塞塞住中間一口并連接上 N2排氣裝置，進行氮氣排氣。 稱取二芐基二硒 111mg（ ），使用無水 DMF5ml溶解，并注入三口圓底燒瓶中 。繼續(xù)啟動氮氣排氣操作，在氮氣保護下 ， 從三口瓶左口加入 150mgNaBH4，塞上左口，停止氮氣排氣操作， 將燒瓶置與提前升溫為 60度的油浴鍋中， 使用磁力攪拌器攪拌反應 二十 分鐘 。在反應時間到后， 將事先使用 6mlDMF溶解的 141mg（ ）荷葉堿使用注射器從橡皮塞口注入燒瓶 ， 調(diào)節(jié)溫 度至 140度， 反應 2h，停止反應。 現(xiàn)象：二芐基二硒為黃色粉末，易容與 DMF中，顯淡綠色，在加入 NaBH4后無明顯現(xiàn)象，溫度 60 度下反應二十分鐘后，溶液漸漸變?yōu)闇\棕色。當加入荷葉堿反應 1h 后，溶液顯橙黃色，反應 2h后溶液顯棕色。 （ 2）分離純化荷葉堿 G1 使用毛細管吸取并點樣反應所得的反應液于 2*5cmGF254薄層板 ， 同時 點荷葉堿對照 ，使用氯甲比 20:1展開，觀察結果 。結果顯示反應有新化合物產(chǎn)生，且 主產(chǎn)物 極性略大于荷葉堿，推測其為荷葉堿 G1。 在反應液中加入 10%稀 H2SO4調(diào)節(jié) PH至 3左右，此時觀察 到燒瓶中的沉淀逐漸溶解，將溶液轉入 100ml分液漏斗中，分出下層水層。使用 1mol/L的 NaOH調(diào)節(jié)水層 PH至 9，發(fā)現(xiàn)析出大量沉淀，加入 100ml氯仿萃取溶液兩次，將氯仿萃取液旋蒸濃縮至 1ml，吸取濃縮液點樣于 GF254薄層板上，并且點荷葉堿做對照，于氯甲比 20:1的展開劑中展開，觀察結果。結果顯示，反應雜質(zhì)得到初步分離，濃縮液中位荷葉堿及反應產(chǎn)物。 將濃縮液點樣于 20*20的 GF254薄層板上，使用氯甲比為 20:1的展開劑重復展開兩次，在 254nm 熒光下觀察與產(chǎn)物所在區(qū)帶，使用鉛筆劃出并用刮刀刮下該層。 將刮下的硅膠塊研碎，裝柱于小玻璃管中