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正文內(nèi)容

張亞平,蛋白質(zhì)組技術(shù)(編輯修改稿)

2025-06-19 04:31 本頁面
 

【文章內(nèi)容簡介】 再加大上樣量,重作電泳,用考馬斯亮藍染色 純化的樣品經(jīng)脫色后進一步進行質(zhì)譜鑒定 差異凝膠電泳( Differential gel electrophoresis) 質(zhì)譜儀的基本組成 進樣系統(tǒng) 離子源 質(zhì)量分析器 檢測器 ? ? ? ? 質(zhì)譜圖意義 A: 離子的相對強度 (Y axis) B: 離子的質(zhì)量與電荷比 (m/z, X axis) C: 質(zhì)譜圖中最強的峰稱為基峰 (base peak) D: 相對于特定的檢測器時稱為峰的絕對強度 E: 所有質(zhì)譜峰對應(yīng)的是離子電信號強度和離子應(yīng)在 m/z位置而非真實的離子強度和離子 . F: 棒狀譜 (centroidal peak) G: 高斯峰 (gauss peak) ● 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜 ( MALDITOF) ( 1) 主要技術(shù) ? 基質(zhì)輔助激光解吸電離 (Matrixassisted laser desorption/ionization, MALDI)技術(shù) ? 線性飛行時間質(zhì)量檢測器 (time of flight,TOF) MALDI原理: 將分析物分散在基質(zhì)分子 (尼古丁酸及其同系物 )中并形成晶體 , 當用激光 (337nm的氮激光 )照射晶體時 , 基質(zhì)分子吸收激光能量 , 樣品解吸附 , 基質(zhì) - 樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使樣品分子電離 。 基質(zhì) 的使用是這一電離技術(shù)的關(guān)鍵 , 基質(zhì)吸收了激光的大部分能量并氣化 , 同時將樣品分子帶入氣相 , 樣品分子只吸收少量激光能量 , 避免 了 分子化學(xué)鍵的斷裂 。 基質(zhì)在樣品離子形成過程中充當了質(zhì)子化或去質(zhì)子化試劑 , 使樣品分子帶上 正電荷或負電荷 。 TOF原理 ?離子源中每一脈沖激光產(chǎn)生的離子先經(jīng)過一個加速電場 , 獲得動能 , 再進入一個高真空無電場飛行管道 . 離子在此無電場飛行管道內(nèi)以在加速電場獲得的速度飛行 。 質(zhì)量較輕的離子飛行速度快 , 較早到達檢測器 , 較重的離子飛行速度慢 , 較晚到達檢測器 , 離子的飛行時間與其質(zhì)荷比的平方根 (m/ z) 成正比 , 通過檢測飛行時間來測定離子的質(zhì)荷比 。 酵母雙雜交技術(shù) 一、酵母雙雜交系統(tǒng)的原理 二、酵母雙雜交系統(tǒng)的操作程序 三、酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用 四、酵母雙雜交系統(tǒng)的局限與發(fā)展 酵母雙雜交系統(tǒng)( Yeast twohybrid system) 也叫相互作用陷阱( Interaction trap) 由 Fields和 Song于 1989年建立 用于研究 細胞內(nèi) 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用。 (一)、酵母雙雜交技術(shù)原理 酵母雙雜交系統(tǒng)的建立基于對真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)構(gòu)與功能的認識 真核生物轉(zhuǎn)錄激活因子 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域 BD AD 組件式:結(jié)構(gòu)可互相分開 功能互相獨立 空間較近時表現(xiàn)活性 中間序列對活性無影響 酵母轉(zhuǎn)錄因子 GAL4 N端 C端 147AA 213AA BD AD LexA蛋白 單純皰疹病毒的 VP編碼區(qū) BD AD 大腸桿菌的 LexA蛋白 選擇酵母細胞作為雙雜交系統(tǒng)的宿主菌株: 2. 酵母細胞有很多的營養(yǎng)缺陷型標記,篩選陽性克隆比較方便、容易。 3. 酵母細胞有性生殖形成二倍體細胞,轉(zhuǎn)化容易,轉(zhuǎn)化率高 構(gòu)建兩種可
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