蛋白組學(xué)翻譯后修飾(編輯修改稿)
2025-06-18 06:23 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 抗體免疫印跡法 ? 優(yōu)點(diǎn) ? 靈敏 ? 直觀 ? 克服同位素法的局限 ? 無同位素污染，操作相對(duì)方便 ? 可檢測(cè)無磷酸化轉(zhuǎn)換的蛋白 ? 能區(qū)分不同殘基的磷酸化 磷酸化肽段的分離和富集 ? 使用磷酸化蛋白的抗體 ? IMAC法 ? 磷酸基團(tuán)親和取代 磷酸化蛋白的抗體 ? 目前已經(jīng)開發(fā)出針對(duì)特異磷酸化位點(diǎn)的單克隆抗體， ?pTyr， ?pSer， ?pThr ? 利用這些單克隆抗體進(jìn)行親和純化，可以分離和富集特定磷酸化的蛋白 固定金屬鰲和親和層析 (Immobilized metal affinity chromatography ， IMAC) ? IMAC技術(shù)是用于富集磷酸化的肽段，對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)的富集是無效的。 ? 利用了磷酸基團(tuán)的負(fù)電性，與 IMAC柱上的帶正電的金屬離子結(jié)合，從而起到純化的作用。 ? IMAC技術(shù)對(duì)絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化都有效 ? IMAC技術(shù)使用的金屬離子主要是 Fe3+、 Ga3+ 、 Cu2+等 ? 最主要的缺點(diǎn)是特異性不強(qiáng)： IMAC柱上的正電荷位點(diǎn)同樣會(huì)與肽段中的天冬氨酸、谷氨酸和組氨酸殘基結(jié)合 ? 對(duì)磷酸化肽段中的酸性殘基進(jìn)行了預(yù)先的甲基酯化，封閉了上述氨基酸的酸性側(cè)鏈。 IMAC 填料－交聯(lián)劑－金屬螯合劑－金屬離子 MS MS/MS 磷酸基團(tuán)親和取代 ? 將磷酸肽上的磷酸基團(tuán)用另一種配基取代，再用親和純化的方法分離富集磷酸肽 ? 生物素取代 生物素取代 以 ?干酪素做測(cè)試 磷酸肽的識(shí)別 ? MALDI－ TOF－ MS結(jié)合磷酸酶水解法 ? 磷酸酯酶處理蛋白質(zhì)的前后，磷酸化
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