專題三核酸電泳技術(shù)(編輯修改稿)
2025-06-14 22:20 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 。 瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳用的分子質(zhì)量標準可以從市場購得 ， 或者實驗室自己制備 。 一般最好有兩套分子質(zhì)量范圍的標準 ， 一個是 1kb到大于 20kb的高分子質(zhì)量標準 ， 一個是 1001000bp的低分子質(zhì)量標準 。 分子質(zhì)量標準貯備液用凝膠載樣緩沖液稀釋后用于每次電泳實驗 。 溴化乙錠 ? 溴化乙錠首先于 20世紀 50年代合成成功 ， 主要是作為一種有效的殺錐蟲制劑而發(fā)展起來的菲啶化合物 。溴化乙錠在篩選過程中脫穎而出 。 它的殺錐蟲效能是其母化合物的 10～ 50倍 ， 并對小鼠無毒 ， 且與早期的菲啶化合物不同 ， 對牛不具有光致敏作用 。 直到最近 ， 溴化乙錠在熱帶及亞熱帶國家仍被廣泛應用于牛錐蟲病的治療和預防 。 溴化乙錠與核酸結(jié)合 ? 溴化乙錠包含一個平面的三環(huán)菲啶環(huán) ， 它能插入到雙鏈 DNA堆疊的堿基對之間 。 當它插入到螺旋結(jié)構(gòu)中 ， 將保持與螺旋結(jié)構(gòu)縱軸垂直的位置 ， 并在其上下方與堿基對形成范德華接觸 。 盡管其平面三環(huán)結(jié)構(gòu)被包埋 ， 其外圍苯基及乙基基團卻伸出插入到 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的大溝中 。 在高離子強度的溶液中 ， 大約每 ， 且與DNA的堿基組成無關(guān) 。 除沿螺旋縱軸方向發(fā)生 移外 ， 堿基對的幾何結(jié)構(gòu)和位置相對于螺旋結(jié)構(gòu)并未發(fā)生改變 。 這使得與溴化乙錠結(jié)合達到飽和的雙鏈 DNA的長度增加了 27％ 。 ? 溴化乙錠也同樣可以通過不同的化學作用方式與 RNA以及熱變性或單鏈 DNA鏈內(nèi)堿基對所形成的螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)相結(jié)合 。 ? 溴化乙錠平面基團的固定位置以及它與堿基的高度臨近使被結(jié)合的染料所產(chǎn)生的熒光與在自由溶液狀態(tài)的染料相比增強 20～ 25倍 。 254 nm的紫外線首先被 DNA吸收 ，然后被傳送到染料；而 302nm以及 366 nm的射線直接被染料自行吸收 。 這些被吸收的能量將在 590nm的橙紅色可見光譜區(qū)以 。 ? 大部分商品化的紫外線光源產(chǎn)生 302 nm的紫外線 。 溴化乙錠 DNA復合物在受到紫外線照射激發(fā)所產(chǎn)生的熒光 ，在 302nm的紫外線下明顯要比 366nm的要強 ， 但要比短波紫外線 (254nm)的稍弱 。 然而 ， 302 nm紫外線所造成染料的光褪色效應以及造成 DNA的斷裂和缺口明顯要較 254nm紫外線少得多 。 凝膠中 DNA的染色 ? 溴化乙錠被廣泛地用于瓊脂糖凝膠中 DNA片段的定位 ， 通常將它以。 盡管加入溴化乙錠會導致線性雙鏈 DNA的電泳遷移率減慢～ 15％ ， 但卻可在紫外燈下直接檢查凝膠 。 由于溴化乙錠 DNA復合物的熒光強度要比未結(jié)合的染料強很多 ， 少量的 DNA(～ 10 ng／條帶 )也能從存在游離狀態(tài)溴化乙錠的凝膠中被檢測出來 。 ? 當需要知道 DNA片段的準確大小 (如 DNA限制酶酶切圖譜的鑒定 )， 凝膠應該在無 EB情況下電泳 ， 電泳結(jié)束后用 EB染色 。 染色時 ， 將凝膠浸入含有 EB()的電泳緩沖液中 ， 室溫下染色 30～ 45 min。 染色完畢后 ， 通常不需要脫色 。 但是在檢測小量 DN
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