第三章核酸技術(shù)(編輯修改稿)
2024-11-29 14:44 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 肽鏈 抗體復(fù)合物 不溶性交聯(lián)抗原基 質(zhì)親和層析柱吸附 洗脫 免疫沉淀法優(yōu)點(diǎn)：可分離到含量?jī)H為 1%的 mRNA，但必須使用高純度的抗體，不能發(fā)生交叉反應(yīng)和污染核酸酶 2) 多聚核糖體 RNA的分離 純化多聚核糖體 +SDS 蔗糖密度梯度離心或蛋白酶 K苯酚抽提 4. RNA的分級(jí)分離 1) 分子量大小分級(jí)分離 i. 蔗糖密度梯度離心 ii. 凝膠電泳 2) 核酸序列分級(jí)分離 i. 分子雜交法：適用于同源性很高的 RNA的分離 DNA分子變性 結(jié)合到 NCF RNADNA雜交 洗滌 洗膜 乙醇沉淀 ii. 親和層析法： 低聚 dT纖維素 : 用于 poly(A)較長的 mRNA； 多聚 U瓊脂糖 : 用于 poly(A)較短的 mRNA（ 20A） RNA進(jìn)樣吸附 洗滌 洗脫 收集 260nm處吸收峰樣品 乙醇沉淀 iii. 無 poly(A) mRNA的分離 純化多聚核糖體 核糖體亞基 +mRNP 離心 mRNP 蛋白酶 K mRNA 低聚（ dT）纖維素層析 洗出液 乙醇沉淀（無多聚 A mRNA） 5. RNA的質(zhì)量評(píng)估方法 1) 光密度值測(cè)定法 A260/A280= 2) 凝膠電泳 3) 體外蛋白質(zhì)翻譯 細(xì)胞裂解物 胍鹽法 總 RNA 分子雜交法 — 特異 RNA分子 熱苯酚法 凝膠電泳 圍 RNA 大小分級(jí)分離 大小范 蔗糖密度 梯度離心 一定 LiCl/ 核酸序列 尿素法 離心 分級(jí)分離 親和層析法 — poly（ A） RNA分子 高速離心法 全部多聚核糖體 上清液 鎂鹽沉淀法 蔗糖密度梯度離心 — 結(jié)合與 游離多聚核糖體 分級(jí)分離法 蔗糖連續(xù)密度 — 一定范圍大小核糖體 多聚核糖體 RNA 免疫沉淀法 —— 特異性多聚核糖體 第二節(jié) 核 酸 電 泳 1. 種類 1) 按凝膠材料分 : 聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳 (普通瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖 ) 2) 按電泳裝置分 : 水平式 /瓊脂糖凝膠 。 豎式 /聚丙烯酰胺凝膠 3) 兩種方法比較：分離效果和分離范圍 。 操作難易 2. 用途 瓊脂糖凝膠用于 DNA和 RNA的常規(guī)分析；聚丙烯酰胺凝膠常用于小分子核酸分析。 3. 凝膠電泳的一般程序 制膠 點(diǎn)樣 電泳 染色 觀察 二 、 DNA電泳 1. DNA分子種類 1) 線狀 DNA— 單鏈與雙鏈 ， ssDNA電泳時(shí)要注意局部區(qū)域形成 dsDNA， 造成遷移距離不確定 2) 環(huán)狀 DNA— 單鏈 （ 如 M13mp） 和雙鏈 （ 質(zhì)粒 DNA） 3) 線狀 dsDNA電泳 — 使用頻率最高的一種電泳 這類 DNA分子在電泳過程中遷移的距離受以下幾個(gè)因素的影響： i. 分子量 的大小 : 遷移距離與分子量的 常用對(duì)數(shù) 成反比 ii. 凝膠濃度 : 濃度越高，移動(dòng)距離越短，適合分離低分子量DNA濃度越低，移動(dòng)距離越長，適合分離高分子量 DNA : 低電壓時(shí)，遷移率與電壓成正比；電壓增高時(shí)，不同大小 DNA片段遷移率增大是不同的。 : 不受影響 ,溫度高可導(dǎo)致 DNA帶變形或解鏈。 4) 環(huán)狀 dsDNA電泳 : 常用于質(zhì)粒 DNA的初步鑒定 5) 線狀 ssDNA電泳 鏈分離凝膠 ：化學(xué)定序時(shí)，用于單鏈分離。 DNA雙鏈互補(bǔ)，但組成不一樣，仍可分離（機(jī)理不詳），電泳時(shí)形成三條帶：變性雙鏈，兩條單鏈。 核酸定序凝膠 (染料指示劑 )：為避免局部區(qū)域產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)，可采用各種變性措施，如煮沸樣品，提高電泳溫度，凝膠中加入變性劑（尿素、甲醛、甲胺等） 三 . RNA凝膠電泳 方法：不同的 RNA電泳方法是依據(jù)使 RNA分子變性所采取的方法。這些方法不僅要使 RNA分子在點(diǎn)樣時(shí)是一級(jí)結(jié)構(gòu)，
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