第三章核酸技術-資料下載頁
2025-10-15 14:44本頁面
【導讀】核酸的分離和純化。DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制。分離總DNA分離細胞器分離總RNA. 感染或轉染細胞（病毒型）轉化細菌細胞（質粒型）。分離病毒顆粒培養(yǎng)轉化細胞、收集菌體。2）光密度值測定。利用某些細胞壁裂解酶使細胞變?yōu)樵|體，然后加去垢劑。使原生質體裂解。2)酵母：蝸牛酶、Novozyme234、glusulase、zymolase等。足酶的最佳反應條件。淀物用70%冷乙醇洗滌,干燥溶于緩沖液加入RNAase處理。CsCl法操作步驟少，分離DNA分子量大，耗財多，且需超速。苯酚法耗時少，不需昂貴儀器，但操作步驟多，易使DNA分。若小心操作，所獲DNA亦符合要求。分離線粒體DNase除去細胞器外DNA加入EDTA使。仍保持環(huán)狀結構，當變性條件發(fā)生迅速變化時，前者仍不能復性，變性條件可采用加熱煮沸法或堿變性法。上述方法亦可用于ss環(huán)狀病毒DNARF型的分離,質粒DNA的氯霉。ii.核糖體大小分級分離，利用連續(xù)密度梯度分離特大和特小的。用高純度的抗體，不能發(fā)生交叉反應和污染核酸酶。2)核酸序列分級分離
【正文】 個或多個交變電場 ， 使 2003000 kb的 DNA分子發(fā)生分離 ， 其電極排列可以是雙向非均勻 ， 單向非均勻等 。 脈沖場凝膠電泳原理圖 北 南 脈沖場電泳 常規(guī)電泳 兩組電極，排列不均勻 。 一組電極，電場方向不變，電極排列均勻， 定時改變電場方向， DNA分子的凈 DNA移動方向與電場方向相同。整個電泳 移動方向與兩電場呈 45o，在電泳過 過程保持電壓穩(wěn)定。常規(guī)方法制備 DNA 程中，電壓有時可隨時間的增加而樣 品增加， 制備 DNA樣品與常規(guī)方法 不同 2. 場倒置凝膠電泳（ FIGE） 利用常規(guī)電泳槽進行電泳，但電場方向則是周期性地發(fā)生倒置，其正向和反向的脈沖時間長度之比為 3或其它比值。該法可使 15700 Kb或以上的 DNA分子發(fā)生分離。 為了克服同移動現(xiàn)象產(chǎn)生（即不同大小 DNA分子一起移動），可以采用 轉換時間遞增法 （ swichinginterval ramps） , 即由電泳開始時的短脈沖時間逐漸遞增到電泳結束時的長脈沖時間。如開始時為 60： 20，結束時可為 180： 60。 上述兩種方法也可聯(lián)合使用，使一些很難分開的大分子 DNA分離。 3. CHEF(ContourClamped Homogeneous Electric Fields) 動態(tài)調控閉合均一電場電泳 場倒置電泳 CHEF(動態(tài)調控閉合均一電場電泳 ) 各種脈沖場凝膠電泳技術的比較 方法 染色體帶 最大帶 最小帶 動態(tài)調節(jié) 直道 均勻電場 液體樣品 機械轉換 CHEF 15 12020kb 88 bp 是 是 是 是 不 OFAGE 13 9000kb 5000 bp 不 不 不 是 不 TAFE 13 9000kb 2020 bp 不 是 不 不 不 FIGE 11 2020kb 200 bp 不 是 是 是 不 RFGE 15 ? 202000 bp 不 是 是 不 是 三．影響染色體 DNA電泳的主要因素 1．染色體的結構 2．電泳槽電極的構型 3．電壓：它與脈沖時間成反比 4．脈沖時間 ： 經(jīng)過實驗選擇適合于某種生物染色體 DNA完 全分離的最佳脈沖時間 5．其它因素 ：溫度，離子強度等 四．染色體 DNA樣品的制備 染色體 DNA電泳的關鍵之一是獲得完整的 DNA分子，其制備方法有： 1．固體塊法 細胞培養(yǎng)，收集，洗滌，細胞懸液 與細胞壁裂解酶液和低熔點瓊脂糖凝膠混合 倒平板 復蓋裂解酶緩沖液 細胞壁裂解過夜 除去緩沖液 加入去污劑和蛋白酶 K 反應過夜 換 ， 4℃ 保存 2．微球法 制備細胞懸液 與石蠟油和低熔點瓊脂糖凝膠迅速混合，形成小球 冰浴迅速冷卻 離心，洗滌 加入原生質體形成液， 37℃ 反應至細胞壁裂解 加入裂解液 50℃ 1 h 離心，小球保存于 EDTA， 4℃ 3．加樣 切一小塊樣品凝膠塊或吸取適量微球，置于電泳用凝膠塊的樣品孔中，用少許低熔點瓊脂糖凝膠使樣品與整塊凝膠為一體，每一樣品孔應含 DNA樣品 4. 限制酶切 加樣前取適量樣品 ， 置于 EP管中 ， 加限制酶緩沖液和限制酶進行酶切 五．染色體 DNA電泳的用途 1. 測定染色體數(shù)目 ：特別適合于低等真核生物 2. 測定基因連鎖關系 ：結合 DNA雜交技術，可適合于各種生物 3. 染色體 DNA重排分析 1）酵母細胞經(jīng) X射線照射，染色體發(fā)生斷裂，可得彌散型。 但讓其修復后，又可形成帶，但有的發(fā)生了重排，導致 帶型變化 2）非洲錐蟲：變異表面糖蛋白基因的表達 4. 疾病的診斷 引起某種皮膚病的原生動物 Leishmania, 具有其特征性的染色體。 PFG便可用于診斷。
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