第三章核酸技術(shù)-文庫吧資料
2024-11-01 14:44本頁面
【正文】 稱之為 SDSPAGE。 步驟： RNA+10mM羥甲基醛 點樣在含 4mM羥甲基醛的瓊脂糖凝膠上 電泳 染色觀察 3. 甲醛法 步驟： RNA+ +50%甲胺 點樣在含 糖凝膠上 MOPS緩沖液電泳 染色觀察 其它變性劑，如尿素、甲胺等也可用于 RNA電泳 . 4. 三種方法的比較 第一種方法安全，但由于反應(yīng)是不可逆的，由此回收的 RNA樣品用于體外翻譯效果不好。這些方法不僅要使 RNA分子在點樣時是一級結(jié)構(gòu)，而且在整個電泳過程中也保持一級結(jié)構(gòu)。 DNA雙鏈互補，但組成不一樣，仍可分離（機理不詳），電泳時形成三條帶：變性雙鏈，兩條單鏈。 : 不受影響 ,溫度高可導(dǎo)致 DNA帶變形或解鏈。 操作難易 2. 用途 瓊脂糖凝膠用于 DNA和 RNA的常規(guī)分析；聚丙烯酰胺凝膠常用于小分子核酸分析。DNA雜交 洗滌 洗膜 乙醇沉淀 ii. 親和層析法： 低聚 dT纖維素 : 用于 poly(A)較長的 mRNA； 多聚 U瓊脂糖 : 用于 poly(A)較短的 mRNA（ 20A） RNA進樣吸附 洗滌 洗脫 收集 260nm處吸收峰樣品 乙醇沉淀 iii. 無 poly(A) mRNA的分離 純化多聚核糖體 核糖體亞基 +mRNP 離心 mRNP 蛋白酶 K mRNA 低聚（ dT）纖維素層析 洗出液 乙醇沉淀（無多聚 A mRNA） 5. RNA的質(zhì)量評估方法 1) 光密度值測定法 A260/A280= 2) 凝膠電泳 3) 體外蛋白質(zhì)翻譯 細胞裂解物 胍鹽法 總 RNA 分子雜交法 — 特異 RNA分子 熱苯酚法 凝膠電泳 圍 RNA 大小分級分離 大小范 蔗糖密度 梯度離心 一定 LiCl/ 核酸序列 尿素法 離心 分級分離 親和層析法 — poly（ A） RNA分子 高速離心法 全部多聚核糖體 上清液 鎂鹽沉淀法 蔗糖密度梯度離心 — 結(jié)合與 游離多聚核糖體 分級分離法 蔗糖連續(xù)密度 — 一定范圍大小核糖體 多聚核糖體 RNA 免疫沉淀法 —— 特異性多聚核糖體 第二節(jié) 核 酸 電 泳 1. 種類 1) 按凝膠材料分 : 聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳 (普通瓊脂糖和低熔點瓊脂糖 ) 2) 按電泳裝置分 : 水平式 /瓊脂糖凝膠 。 3. 多聚核糖體 RNA的制備 1) 多聚核糖體的分離 ① 超速離心法（ 3040萬 g，離心 23 h） ② 鎂鹽沉淀法（ M Mg++） ③ 分級分離法 — 分離特異性多聚核糖體 i. 結(jié)合與游離核糖體 的分離，這種方法可避免溶酶體破裂。HCl除外）和器皿，操作者帶手套 內(nèi)源 RNase— 高溫抽提，強蛋白質(zhì)變性劑，RNase抑制劑，蛋白酶 K等 2. 總 RNA的制備 根據(jù)所用蛋白質(zhì)變性劑種類不一樣分為以下三種制備方法： 1） 熱苯酚抽提法 2） 胍鹽法：異硫氰酸胍和硫氰酸胍 3） LiCl/尿素法 其中以胍鹽法最好，對于從那些 RNase含量很高的組織（胰臟）中提取 RNA特別有效，可使 RNase迅速變性，制備的 RNA有較高翻譯活性。 變性條件可采用加熱煮沸法或堿變性法 上述方法亦可用于 ss環(huán)狀病毒 DNA RF型的分離 , 質(zhì)粒 DNA的 氯霉素擴增 使用并不廣泛（菌株和載體） 2) 噬菌體載體 DNA的分離 純凈病毒顆粒 病毒載體 DNA M13mp載體可采用質(zhì)粒 DNA的分離方法 二、 RNA的分離與純化 1. 制備 RNA的關(guān)鍵 — 防止內(nèi)外源 RNase的作用 1) RNase的特點：抗酸抗堿 ,具很廣 pH作用范圍 。 ** 上述兩種分離方法都包含了下述四個分離步驟 ⅰ .可溶與不可溶物分離：高速離心除去細胞碎片，保留上清液。
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