核酸分離純化技術(shù)ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-28 01:09 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 可中和磷酸根的電負(fù)性，保持雙鏈結(jié)構(gòu)。現(xiàn)在較普遍是將 DNA溶于 TE溶液（ 10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH ）， 20℃ 保存。而 RNA則通常溶于 DEPC水中。 （六）核酸制劑純度的初步鑒定 純凈的核酸制品在 260 nm波長處有吸收高峰， 230 nm為吸收低谷。 核酸的紫外吸收曲線 純度： A260/A280 ：雙鏈 DNA為 ，而 RNA為 。 含量： ? 50 A260樣本 稀釋倍數(shù)／ 1000＝雙鏈DNAug/ul ? 40 A260樣本 稀釋倍數(shù)／ 1000＝單鏈DNA／ RNA ug/ul ? 33 A260樣本 稀釋倍數(shù)／ 1000＝單鏈寡聚核苷酸 ug/ulDNA 第二節(jié) 酚－氯仿抽提法分離基因組 DNA 酚／氯仿抽提 DNA的原理 ? 去除蛋白質(zhì)最經(jīng)典的方法是酚／氯仿抽提法，也是最常用的方法。 ? 酚氯仿抽提法的原理是：利用核酸與蛋白質(zhì)對苯酚的變性作用具有的不同反應(yīng)性分離核酸與蛋白質(zhì)。在細(xì)胞破碎步驟后的樣品混合液中用苯酚抽提和高速離心后，樣品中的蛋白質(zhì)成分被變性，或者變成不溶性物質(zhì)，而核酸則溶解在水相中。 ? 苯酚抽提通常采用苯酚、氯仿和異戊醇的混合溶液。這種混合溶液比單純的苯酚更有效地使蛋白質(zhì)變性，并且有助于穩(wěn)定RNA，隨后氯仿、異戊醇抽提，將殘留苯酚從水相中（含核酸）除去。最后用乙醇沉淀 DNA，同時(shí)也可去除殘留的氯仿 試劑配制要求及作用 ? 酚的重蒸餾和平衡 ? 酚易氧化，其氧化產(chǎn)物對 DNA有破壞作用，使用前需要將酚進(jìn)行重蒸餾。苯酚 65℃ 熔化后，用空氣冷凝管進(jìn)行重蒸餾， 183℃ 收集純凈酚。 ? 由于酚是中強(qiáng)酸使用前要進(jìn)行酚的平衡，在純凈酚中加入等體積的 1mol/lTrisHCl緩沖液()并加入固體 Tris，激烈震蕩使酚的 pH值平衡到 。酚中常加入抗氧化作用的 8羥基喹嚀， 8羥基喹嚀使酚呈現(xiàn)黃色，可作為指示顏色。將酚保存于棕色瓶中，表面覆蓋一層()防止氧化。 ? 酚／氯仿／異戊醇混合液配制 ? 氯仿為揮發(fā)性有機(jī)溶劑，可使蛋白質(zhì)變性，加入氯仿可以 : ? ； ? ； ? 。 ? 異戊醇可消除抽提時(shí)有機(jī)相和水相之間產(chǎn)生的氣泡，有利于分層。 ? 通常按酚 ∶ 氯仿 ∶ 異戊醇＝ 25∶ 24∶ 1比例將三種試劑混合，要求用時(shí)臨時(shí)配制。 主要所需的試劑及消耗品 : ? TES溶液 ? 蔗糖 TES溶液 ? 溶菌酶 (50mg/ml) ? EDTA溶液 () ? SDS溶液 (10g/l) ? 飽和酚 :氯仿 :異戊醇 () ? NaAc（ 3mol/l） ? 無水乙醇， 70%的乙醇 ? 實(shí)例： ? 原核生物（大腸桿菌）基因組 DNA的分離純化過程 ? 1. 吸取已培養(yǎng)好的大腸桿菌液體 試管中 ,4000轉(zhuǎn) /min離心 15min，棄去上清，加入一定體積的 TES液，洗菌體 1~2次，如上述方法收集菌體，將培養(yǎng)細(xì)菌的一些營養(yǎng)物的清洗干凈。 ? 2. 棄去 TES液后，管底菌體大約 200ul177。 ，加入五倍體積的預(yù)冷蔗糖 TES液約 1ml，在冰浴中充分混勻，加入溶菌酶（ 50mg/ml）至終濃度 1mg/ml，（計(jì)算方法，50 x=1 1,x=）充分混勻后，在0℃ 處理 15min ? 該步驟作用為破壞細(xì)胞壁，為了防止酶的變性，需低溫處理，同時(shí)加 EDTA抑制 DNA酶。 ? 3. 加入 EDTA（ ）至終濃度為 (計(jì)算為 X=（ 1+X）約取 600~700ul輕輕混勻后， 0℃ 處理 10min。充分抑制DNA酶的活性，再加入 SDS或（蛋白酶 K）溶液至終濃度為 10g/l，混勻，于 37℃ 裂解 30min， 94℃ 裂解 1min。 ? 該步驟為裂解細(xì)胞膜：裂解胞膜可以用蛋白酶 K，由于蛋白酶 K價(jià)格較高，所以常用 SDS（胞膜雙脂層。 SDS為十二烷基磺酸鈉，為一種表面活性劑，能破壞雙脂層）常配制的 SDS為 100g/l，加入時(shí)據(jù)體系中的總體積進(jìn)行計(jì)算（ 100x=10 ,x=180ul→ 200ul177。 ） ? 37℃ 裂解后，呈現(xiàn)為高粘稠性半透明溶液，將試管內(nèi)的裂解液分裝在兩個(gè) ，約 177。 。取其中一管進(jìn)行下一步試驗(yàn)，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（ 25： 24： 1）抽提（由黃色變?yōu)槿榘咨?，?12022轉(zhuǎn) /min離心
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