核酸雜交技術(shù)ppt課件(編輯修改稿)
2025-02-15 22:17 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 易破裂。在酸性、堿性、中性、各種離子強度條件下，核酸均可以共價鍵與尼龍膜結(jié)合，非常牢固。在保持完整的情況下，尼龍膜可以多輪雜交，即在第一輪雜交之后，將探針分子變性洗脫，可以再與第二種探針雜交。 ? 用于印跡雜交的尼龍膜有普通尼龍膜和正電荷修飾尼龍膜兩種。正電荷修飾尼龍膜與核酸的結(jié)合能力更強，靈敏度更高。 二、印跡方法 ? 印跡（ blotting）是指將凝膠中的待測核酸等樣品用類似于吸墨跡的方法轉(zhuǎn)移到固相膜上，轉(zhuǎn)移之后待測樣品在固相膜上的相對位置保持不變。 ? ? 利用虹吸作用使緩沖溶液定向滲透，帶動樣品從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相膜上。樣品轉(zhuǎn)移速度主要取決于樣品分子大小、凝膠濃度和凝膠厚度。 ? 有兩種毛細管法： ① 向上毛細管法：液流自下而上虹吸 ② 向下毛細管法：液流自上而下虹吸， ① 向上毛細管法：液流自下而上虹吸 ② 向下毛細管法：液流自上而下虹吸， ? 2．真空轉(zhuǎn)移法 ? 是利用真空作用將緩沖溶液從上層儲液器中通過凝膠和固相膜抽到下層真空室內(nèi)，同時帶動樣品分子移出，結(jié)合到固相膜上。 ? 優(yōu)點 ：簡便、快速、高效，并且可以在轉(zhuǎn)移的同時對核酸進行變性和中和處理。 ? 注意事項 ：保持凝膠表面平整，厚度均勻，否則在真空作用下凝膠會破裂；在轉(zhuǎn)移過程中真空度不宜過高，以免凝膠被壓緊，反而降低轉(zhuǎn)移效率。 ? 3．電轉(zhuǎn)移法 ? 是通過電泳使凝膠中的帶電荷樣品沿著與凝膠平面垂直的方向泳動，從凝膠中移出，結(jié)合到固相膜上，是一種簡便、快速、高效的轉(zhuǎn)移方法。 ? 核酸電轉(zhuǎn)移法一般選用尼龍膜而不是硝酸纖維素膜作為固相膜 第四節(jié) 核酸分子雜交技術(shù) 一、 Southern印跡雜交（ Southern blotting) 又叫 DNA印跡技術(shù)。是 1975年由 英國愛丁堡大學(xué)的 。 ? 該技術(shù)是 DNA與 DNA的雜交。 ? Southern印跡雜交是 將電泳分離的待測DNA片段轉(zhuǎn)印并結(jié)合到一定固相支持物上與探針雜交，用標記過的探針檢測待測 DNA的一種方法。 （ 一 ） 基本步驟 ① 樣品制備 ② 電泳分離 ③ 變性 ④ 印跡 ⑤ 固定 ⑥ 預(yù)雜交 ⑦ 雜交 ⑧ 洗膜 ⑨ 檢測與分析 樣品制備 ? 基因組 DNA是從動物細胞或組織中提取。 ? 1）破碎細胞：① 化學(xué)法裂解細胞， ② 用組織勻漿器研磨破碎組織中的細胞 。 ? 2）用蛋白酶和 RNA酶消化大部分蛋白質(zhì)和RNA 。 ? 3）用有機溶劑（酚／氯仿）抽提的方法除去殘余蛋白質(zhì)。 ? 4） 用限制性核酸內(nèi)切酶消化 ， 將其切割成大小不同的片段之后才能用于雜交分析 。 電泳分離 ?將制備好的 DNA樣品在 %~%瓊脂糖凝膠中電泳分離 DNA。 ? DNA的變性 ? 電泳結(jié)束后 ， 對凝膠中的 DNA進行堿變性及中和處理 。 ? 將凝膠置于堿溶液中浸泡 ， 使 DNA原位變性解鏈 ， 形成單鏈 DNA片段 ， 再用中性 pH的緩沖液中和凝膠中的緩沖液 。 印跡 ?將變性后的單鏈 DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上的過程稱為印跡。 固定 ? 轉(zhuǎn)移之后的 DNA 必須固定于固相膜上。 ? 80 ℃ 烘烤可以將 DNA 固定于固相膜上，小劑量紫外線可以使 DNA 以共價鍵與尼龍膜結(jié)合。 預(yù)雜交和 雜交 ?預(yù)雜交 ：將固定后的 DNA樣品用 變性的鮭魚精子 DNA等非特異性的 DNA分子封閉固相膜上未結(jié)合 DNA的位點，以避免探針的非特異性結(jié)合，降低雜交的本底 。 ?雜交 ：加入標記好的探針進行雜交。 ? 用探針雜交液浸泡結(jié)合了待測 DNA 的固相膜，溫育，探針即與待測 DNA 片段進行雜交。 洗膜 ?用不同離子強度的漂洗液依次漂洗固相膜，除去末雜交探針和形成非特異性雜交體的探針，稱為洗膜。 ?非特異性雜交體穩(wěn)定性差，解鏈溫度低，可以在比特異性雜交體解鏈溫度低 5～ l2 ℃ 的條件下解鏈，而特異性雜交體不會解鏈。 檢測與分析 ? 雜交信號的檢測方法有兩種： ? 一種是放射自顯影。用于同位素或發(fā)光劑標記的核酸探針與待測 DNA雜交洗膜后，將纖維素膜和 X光片一起裝入暗盒，使 X光片曝光，沖洗后，在 X光片上可見黑色條帶。 ? 另一種是化學(xué)染色?？芍苯釉谀ど巷@色，顯出雜交條帶。 （二）應(yīng)用 ? Southern雜交技術(shù)主要用于： ① 組建 DNA物理圖譜。 ② 研究基因重排，變異以及基因的限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性分析。 ③ 用于對疾病的診斷 。 二、 Northern印跡雜交（ Northern blotting） ? 1979年 Alwine將 RNA轉(zhuǎn)移到化學(xué)修飾的活性濾紙上而發(fā)明此法。 ? 概念： Northern印跡雜交是將 RNA從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上或其它化學(xué)修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種方法。 ? 用于檢測 RNA（主要是 mRNA） ,用于研究基因表達。 ? 基本步驟： ? ① 提取細胞總 RNA或 mRNA直接進行電泳分離 。為了維持 RNA的單鏈狀態(tài) ， 防止 RNA形成發(fā)夾結(jié)構(gòu) ， 在凝膠中需要加入變性劑 。 ? ② 電泳結(jié)束后 ， 直接采用毛細管虹吸法將凝膠中的 RNA轉(zhuǎn)移到纖維膜上與探針雜交 。 ? 應(yīng)用： ? Northern雜交技術(shù)用于檢測各種基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的大小 、 轉(zhuǎn)錄量及其變化 。
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