【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 edical College 核酸探針雜交法 ? 點(diǎn)雜交 ? 反向點(diǎn)雜交 ? 微孔板雜交 ? 熒光探針雜交法 《 分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 》 模塊 8 核酸擴(kuò)增技術(shù) School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 點(diǎn)雜交（ dot blot） ? 原理：將擴(kuò)增產(chǎn)物變性后直接點(diǎn)在尼龍膜或硝酸纖維素膜上 ， 再用放射性或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的寡核苷酸探針與之雜交 。 ? 探針： – 放射性同位素標(biāo)記探針檢測(cè)的敏感 、 特異 ， 具有不穩(wěn)定性和放射性危害 。 – 非放射性物質(zhì) （ 如生物素 、 地高辛 、 熒光素等 ） 標(biāo)記的探針?lè)€(wěn)定性高 、 使用安全 、 檢測(cè)速度快 ? 用途：主要用于 PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析 。 《 分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 》 模塊 8 核酸擴(kuò)增技術(shù) School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 反向點(diǎn)雜交 (reverse dot blot) ? 原理：使用帶有標(biāo)記物的引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 ， 然后將擴(kuò)增產(chǎn)物變性 。 將不同的寡核酸探針固定在尼龍膜上 ， 用變性的 PCR產(chǎn)物與之雜交 。 ? 探針：嚴(yán)格設(shè)計(jì) ， 具有相同的雜交反應(yīng)條件 。 ? 用途：反向點(diǎn)雜交特別適用于遺傳性疾病多個(gè)位點(diǎn)的點(diǎn)突變分析 。 ? 結(jié)果分析： – 正常純合子 – 突變純合子 – 雜合子 《 分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 》 模塊 8 核酸擴(kuò)增技術(shù) School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 微孔板雜交 ( microplate hybridization) 夾心雜交 《 分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 》 模塊 8 核酸擴(kuò)增技術(shù) School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 熒光探針雜交法 ? 目前臨床上常用熒光探針?lè)▉?lái)檢測(cè) PCR產(chǎn)物，主要的方法有 TaqMan技術(shù)、分子信標(biāo)技術(shù)、復(fù)合探針?lè)ǖ取? 《 分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 》 模塊 8 核酸擴(kuò)增技術(shù) School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College PCR產(chǎn)物測(cè)序 ? 對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序是檢測(cè) PCR產(chǎn)物特異性最可靠的方法 ， 可將 PCR產(chǎn)物克隆到載體上進(jìn)行測(cè)序 ， 也可對(duì)直接 PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序 。 《 分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 》 模塊 8 核酸擴(kuò)增技術(shù) School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 常見(jiàn)問(wèn)題原因分析及處理 ? 假陽(yáng)性 ? 非特異性 PCR產(chǎn)物 ? 假陰性 ? 引物二聚體 《 分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 》 模塊 8 核酸擴(kuò)增技術(shù) School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 假陽(yáng)性 ? PCR產(chǎn)物是最主要的污染源。 ? 含有靶 DNA序列的質(zhì)粒的污染。 ? 陽(yáng)性對(duì)照的污染。 ? 標(biāo)本之間的交叉污染。 ? Taq聚合酶中帶有細(xì)菌 DNA，當(dāng) PCR擴(kuò)增片段為保守的 rRNA序列時(shí)，易造成假陽(yáng)性。 《 分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 》 模塊 8 核酸擴(kuò)增技術(shù) School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 怎么可能全家人都得了性病 ??? ? 何某，女， 46歲，某部隊(duì)衛(wèi)生所護(hù)士，離婚 10年，與一男友交往5年。她近來(lái)忽然感到陰部瘙癢，白帶有異味，想到自己有非婚性行為，怕萬(wàn)一得性病被人知道，便悄悄到郊區(qū)一個(gè)小診所去看病。結(jié)果被告知是 淋病 ，用了許多藥，未見(jiàn)明顯好轉(zhuǎn)。她通過(guò)查書(shū)感到 問(wèn)題嚴(yán)重”，擔(dān)心全家都會(huì)傳染，尤其是正讀初中的女兒被傳染上怎么辦？為了孩子，顧不上面子了。她不僅帶自己的女兒、 70歲老母到醫(yī)院檢查，還動(dòng)員最近與其同居一處的妹妹、妹夫及 14歲的外甥女都到醫(yī)院檢查。醫(yī)師給他們用最先進(jìn)的PCR”檢測(cè)，結(jié)果 6個(gè)人都是 淋球菌感染”！ 《 分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 》 模塊 8 核酸擴(kuò)增技術(shù) School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 非特異性 PCR產(chǎn)物 ? 引物特異性不高 ， 引物用量過(guò)多 ， 應(yīng)調(diào)換引物或降低引物用量 。 ? Taq DNA聚合酶質(zhì)量不好或用量偏高 ， 應(yīng)降低酶量或使用質(zhì)量較好的酶 。 ? Mg2+ 濃度過(guò)高 ， 可適當(dāng)調(diào)節(jié) Mg2+濃度 。 ? 退火溫度過(guò)低 ， 退火及延伸時(shí)間偏長(zhǎng) ， 可提高退火溫度 ，減少退火及延伸時(shí)間 ， 或者采用二溫循環(huán) PCR進(jìn)行擴(kuò)增 。 ? 熱循環(huán)次數(shù)過(guò)多 ， 適當(dāng)增加模板用量 ， 減少循環(huán)次數(shù) 。 《 分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 》 模塊 8 核酸擴(kuò)增技術(shù) School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 假陰性 ? 引物設(shè)計(jì)是否合理 ? 標(biāo)本中是否有 Taq酶抑制劑 ， Taq酶是否失活 。 ? 反應(yīng)體系中有無(wú)蛋白酶或核酸酶降解 DNA聚合酶或模板 DNA，可在 95℃ 以上加熱 10分鐘使其滅活 。 ? 反應(yīng)體系中是否有較難去除的蛋白質(zhì)抑制 PCR系統(tǒng) ， 用蛋白酶 K重新處理常可獲預(yù)期結(jié)果 。 ? 循環(huán)溫度 ， 特別是解鏈溫度是否準(zhǔn)確 ， 退火溫度是否過(guò)高 。 有些PCR儀指示溫度與實(shí)際溫度不符 ， 過(guò)高則酶在前幾個(gè)循環(huán)中迅速失活 ， 過(guò)低則模板變性不徹底 ? 檢測(cè) PCR產(chǎn)物方法靈敏度不夠 ， 如瓊脂糖凝膠電泳法敏感性較低 。 ? 靶序列發(fā)生突變 、 缺失等 《 分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 》 模塊 8 核酸擴(kuò)增技術(shù) School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 引物二聚體 ?兩個(gè)相同的或不同的引物分子之間有較多的堿基配對(duì) ，特別是引物 3’端有互補(bǔ)區(qū) 。 ?引物模板比例太高 ， 可增加模板用量 。 ?退火溫度過(guò)低 。 ?熱循環(huán)次數(shù)過(guò)多 。 ? 《 分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 》 模塊 8 核酸擴(kuò)增技術(shù) School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College PCR污染及預(yù)防措施 ? 分開(kāi)操作區(qū)域。 ? 耐高壓的試劑及器材應(yīng)高溫高壓滅菌。 ? 使用一次性 Tip頭、 Eppendorf管等。 ? 小量分裝試劑。 ? 樣品制備應(yīng)按無(wú)菌操作原則進(jìn)行，避免樣品間相互污染。 ? 操作者帶手套操作，且應(yīng)勤換手套。 ? 使用尿嘧啶 DNA糖基化酶控制 PCR產(chǎn)物交叉污染。 ? 每次 PCR操作都應(yīng)設(shè)陽(yáng)性及陰性對(duì)照 。 《 分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 》 模塊 8 核酸擴(kuò)增技術(shù) School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College RNA酶的污染與預(yù)防 ? 去除外源 RNase污染 – 玻璃器皿常規(guī)洗凈后，應(yīng)用% DEPC處理。 – 所有溶液應(yīng)加 DEPC至%~%，室溫處理過(guò)夜，然后高壓處理。 – 操作者戴口罩和手套。 – 材料器材使用滅菌一次性用品。 ? 抑制內(nèi)源性 RNase的活性 – 使用低特異性 RNase抑制物：如皂土、復(fù)合硅酸鹽、肝素、 DEPC等。 – 去除蛋白質(zhì)物質(zhì)：蛋白質(zhì)變性劑、蛋白酶 K、陰離子去污劑等，常與 RNA酶抑制物聯(lián)合使用，以加強(qiáng)對(duì) RNase活力的抑制。 – RNase的特異性抑制劑：如 RNase阻抑蛋白（ RNasin）、氧釩核糖核苷復(fù)合物。 《 分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 》 模塊 8 核酸擴(kuò)增技術(shù) School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College PCR衍生技術(shù) ? 巢式 PCR（ nested PCR ） ? 逆轉(zhuǎn)錄 PCR（ reverse transcriptionPCR， RTPCR） ? 多重 PCR(multiplex PCR) ? 重組 PCR(rebinant PCR) ? 錨定 PCR（ anchored PCR, APCR） ? 不對(duì)稱 PCR（ asymmetric PCR） ? 反向 PCR（ inverse PCR） ? 擴(kuò)增長(zhǎng)片段 PCR（ long PCR， longdistance PCR） ? 免疫 PCR(immunoPCR) ? 定量 PCR 《 分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 》 模塊 8 核酸擴(kuò)增技術(shù) School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 巢式 PCR（ nested PCR） 《 分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 》 模塊 8 核酸擴(kuò)增技術(shù) School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 逆轉(zhuǎn)錄 PCR（ reverse transcriptionPCR， RTPCR） ?逆轉(zhuǎn)錄酶 ?AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為 42℃ ） ?MoMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為 37℃ ） ?逆轉(zhuǎn)錄引物 ?隨機(jī)引物； ?Oligo(dT)； ?特異性引物。 ?onestep RTPCR：在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄引物、 Taq DNA聚合酶、 PCR引物、 dNTP和緩沖液，直接以 mRNA 為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和 PCR擴(kuò)增，稱為一步法RTPCR。 《 分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 》 模塊 8 核酸擴(kuò)增技術(shù) School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 多重 PCR(multiplex PCR) 《 分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 》 模塊 8 核酸擴(kuò)增技術(shù) School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College