核酸分離檢測(cè)ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-29 18:41 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。 ?Ct值 （ Cycles threshold ） ：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù) . ?Ct值與模板 DNA的起始拷貝數(shù)成反比 。 熒光定量 PCR化學(xué)原理 非特異性熒光標(biāo)記： SYBR Green 特異性熒光標(biāo)記： TaqMan ① SYBR Green I熒光染料的作用原理 ?SYBR Green I ：結(jié)合于雙鏈 DNA小溝。 PCR 反應(yīng)體系中， SYBR 熒光染料特異性地?fù)饺? DNA 雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的 SYBR 染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)。 ?優(yōu)點(diǎn)：與所有雙鏈 DNA 結(jié)合，不必因?yàn)槟０宀煌貏e定制 —— 通用性；價(jià)格相對(duì)較低；一個(gè) PCR 產(chǎn)物可以與多分子的染料結(jié)合，靈敏度很高。 ?缺點(diǎn)：能與非特異性雙鏈 DNA（如引物二聚體）結(jié)合。需要熔解曲線分析。 SYBR Green 熔解曲線分析 ② TaqMan探針法 ? TaqMan 探針是一種寡核苷酸探針，設(shè)計(jì)為與目標(biāo)序列上游和下游引物間的序列配對(duì)。熒光基團(tuán)連接在探針的 5’ 末端，而淬滅劑則在 3’ 末端。當(dāng)探針保持完整時(shí)， 3‘端猝滅基團(tuán)抑制 5’發(fā)射基團(tuán)的熒光發(fā)射。在 PCR的退火期。探針模板發(fā)生特異性雜交。延伸期引物在 Taq酶作用下延伸，到達(dá)探針處， Taq酶有 5’→3’ 外切核酸酶活性，切割探針，熒光發(fā)射基團(tuán)遠(yuǎn)離猝滅基團(tuán)，熒光信釋放。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，熒光基團(tuán)不斷積累。即熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。 ?優(yōu)點(diǎn) ：特異性高、重復(fù)性好、陰性結(jié)果確定、引物設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單 —— 公司網(wǎng)站 ?缺點(diǎn)：只是用于一個(gè)靶基因，成本高。 ③ 定量方法 ?絕對(duì)定量：確定樣品中某一核酸序列的拷貝數(shù)。 ?相對(duì)定量：樣品中某一核酸序列相對(duì)與對(duì)照樣本中同一核酸序列的表達(dá)。 絕對(duì)定量 ?通過標(biāo)準(zhǔn)品定量 ?絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品：已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒 DNA，做系列稀釋。 ?標(biāo)準(zhǔn)樣品的種類：含有和待測(cè)樣品相同擴(kuò)增片段的克隆質(zhì)粒、含有和待測(cè)樣品相同擴(kuò)增片段的cDNA、 PCR的產(chǎn)物 相對(duì)定量 —— 通過內(nèi)標(biāo)定量 ?內(nèi)標(biāo)（ Endogenous Control）通常是 βactin、GAPDH基因等看家基因 ?靶基因表達(dá)的相對(duì)量以靶基因相對(duì)其內(nèi)標(biāo)的 ΔCT表示： ΔCT=靶基因 CTGAPDH CT ?不同樣本靶基因表達(dá)的差異以 ΔΔCT表示，由最高ΔCT與其他各 ΔCT分別相減而得。 ?靶基因表達(dá)的相對(duì)倍數(shù)以 2ΔΔCT表示。 階段 P311平均 CT GAPDH平均 CT ?CT ??CT 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 P5 177。 177。 177。 P11 177。 177。 177。 P14 177。 177。 177。 P30 177。 177。 177。 0 實(shí)時(shí) PCR顯示 P311在肺發(fā)育不同階段的表達(dá) 小鼠肺發(fā)育不同階段 P311 mRNA的表達(dá) 024681012E 1 4 . 5 E 1 6 . 5 E 1 8 . 5 P5 P 1 1 P 1 4 P 3 0P311 表達(dá)相對(duì)倍數(shù)BioRad iQ5TM熒光定量 PCR儀 ABI Prism 7500型熒光定量 PCR儀 膜雜交 Southern Blot —— DNA Northern Blot —— RNA Western Blo
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