核酸分子雜交ppt課件(2)(編輯修改稿)
2025-06-08 04:01 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ? 核酸的保護(hù)（ 內(nèi)源 RNA酶 ） – 低溫、苯酚、氯仿、 SDS可以部分抑制 RNA酶的活性，保護(hù) RNA不被酶解。 ? 探針 – 探針序列需與感興趣的基因互補(bǔ) – 探針需要有熒光或同位素標(biāo)記以利于檢測(cè) – 長(zhǎng)度一般為 252022bp的 DNA或 RNA 實(shí)驗(yàn)原理－ 探針制備 gene X PCR probe U 堿性磷酸酶 OPO3 HPO4 O O 目標(biāo) mRNA Spacer Digoxigenin探針 AntiDigoxigenin Antibody Digoxigenin Hapten Alkaline phosphatase CDPStar 不穩(wěn)定中間產(chǎn)物分解發(fā)光 Northern雜交使用了生物素標(biāo)記。生物素標(biāo)記檢測(cè)是以 DIGdUTP為底物，用隨機(jī)摻入法進(jìn)行 DNA標(biāo)記， PCR合成標(biāo)記有地高辛的探針，然后加入抗地高辛（ DIG） 堿性磷酸酶 復(fù)合物 AntiDIGAP的抗體，利用堿性磷酸酶和化學(xué)底物作用檢測(cè)到雜交的靶 DNA。 實(shí)驗(yàn)原理－信號(hào)檢測(cè) ? 核酸分子雜交又可分為 – 核酸在體外與探針雜交（膜上印跡雜交） – 在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行雜交（細(xì)胞原位雜交） ? 分子雜交可以在液相及固相中進(jìn)行，目前實(shí)驗(yàn)室中廣泛采用的是在固相膜上進(jìn)行的固－液雜交。 ? 膜上印跡雜交 – 將待測(cè)的 DNA或 RNA分子經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后原位轉(zhuǎn)移到固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上 – 雜交液（液相）中的探針與印跡到固相膜上的特異片段發(fā)生雜交 實(shí)驗(yàn)原理 ? 分子雜交的實(shí)驗(yàn)涉及到的三項(xiàng)技術(shù) – 核酸凝膠電泳技術(shù) – 印跡技術(shù) – 分子雜交技術(shù) ? 分子雜交的實(shí)驗(yàn)涉及到的三大內(nèi)容 – 制備被檢的核酸或蛋白質(zhì)樣品 (或標(biāo)本 ) – 制備雜交探針 – 印跡及雜交 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 ? 常規(guī)設(shè)備 – 移液器， tip頭，離心機(jī) ? RNA電泳 – 金屬浴，水 平凝膠電泳儀，微波爐， 紫外凝膠成像系統(tǒng) ? 紫外分光光度計(jì) ? 轉(zhuǎn)膜過程 – 3M濾紙，普通濾紙，尼龍膜，托盤，玻璃板，封口膜， 1000克重物，吸水紙，保鮮膜，手術(shù)刀片，刀柄 ? 預(yù)雜交、雜交 – 水浴搖床，雜交袋，封口器 ? 洗膜、信號(hào)檢測(cè) – 搖床，雜交袋， X光片，暗室，暗盒 實(shí)驗(yàn)試劑 ? RNA提取液（ TSE） ? 100 mmol/L TrisCl ? 20 mmol/L EDTA ? 200 mmol/L NaCl ? 1%SDS ? PVPP 、 β巰基乙醇、苯酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇 ? 瓊脂糖、 MOPS、 EB ? 20 SSC: 3 mol/L NaCl， mol/L 檸檬酸鈉（ PH ） ? 鮭精 DNA ? 雜交液： 7% SDS， 50mmol/L Na3PO4（ pH ）， 2% blocking stock solution， 5 SSC， 50％甲酰胺， %Sodium Nlauroyl Sarcoine ? Buffer I: mol/L maleic acid， mol/L NaCl（ pH ） ? Buffer II: 10% blocking stock solution (Antidig) ? Buffer III: mol/L Tris，
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