核酸分子雜交ppt課件(2)(編輯修改稿)
2025-06-08 04:01 本頁面
【文章內容簡介】 ? 核酸的保護（ 內源 RNA酶 ） – 低溫、苯酚、氯仿、 SDS可以部分抑制 RNA酶的活性，保護 RNA不被酶解。 ? 探針 – 探針序列需與感興趣的基因互補 – 探針需要有熒光或同位素標記以利于檢測 – 長度一般為 252022bp的 DNA或 RNA 實驗原理－ 探針制備 gene X PCR probe U 堿性磷酸酶 OPO3 HPO4 O O 目標 mRNA Spacer Digoxigenin探針 AntiDigoxigenin Antibody Digoxigenin Hapten Alkaline phosphatase CDPStar 不穩(wěn)定中間產物分解發(fā)光 Northern雜交使用了生物素標記。生物素標記檢測是以 DIGdUTP為底物，用隨機摻入法進行 DNA標記， PCR合成標記有地高辛的探針，然后加入抗地高辛（ DIG） 堿性磷酸酶 復合物 AntiDIGAP的抗體，利用堿性磷酸酶和化學底物作用檢測到雜交的靶 DNA。 實驗原理－信號檢測 ? 核酸分子雜交又可分為 – 核酸在體外與探針雜交（膜上印跡雜交） – 在細胞內進行雜交（細胞原位雜交） ? 分子雜交可以在液相及固相中進行，目前實驗室中廣泛采用的是在固相膜上進行的固－液雜交。 ? 膜上印跡雜交 – 將待測的 DNA或 RNA分子經瓊脂糖凝膠電泳分離后原位轉移到固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上 – 雜交液（液相）中的探針與印跡到固相膜上的特異片段發(fā)生雜交 實驗原理 ? 分子雜交的實驗涉及到的三項技術 – 核酸凝膠電泳技術 – 印跡技術 – 分子雜交技術 ? 分子雜交的實驗涉及到的三大內容 – 制備被檢的核酸或蛋白質樣品 (或標本 ) – 制備雜交探針 – 印跡及雜交 實驗原理 實驗設備 ? 常規(guī)設備 – 移液器， tip頭，離心機 ? RNA電泳 – 金屬浴，水 平凝膠電泳儀，微波爐， 紫外凝膠成像系統(tǒng) ? 紫外分光光度計 ? 轉膜過程 – 3M濾紙，普通濾紙，尼龍膜，托盤，玻璃板，封口膜， 1000克重物，吸水紙，保鮮膜，手術刀片，刀柄 ? 預雜交、雜交 – 水浴搖床，雜交袋，封口器 ? 洗膜、信號檢測 – 搖床，雜交袋， X光片，暗室，暗盒 實驗試劑 ? RNA提取液（ TSE） ? 100 mmol/L TrisCl ? 20 mmol/L EDTA ? 200 mmol/L NaCl ? 1%SDS ? PVPP 、 β巰基乙醇、苯酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇 ? 瓊脂糖、 MOPS、 EB ? 20 SSC: 3 mol/L NaCl， mol/L 檸檬酸鈉（ PH ） ? 鮭精 DNA ? 雜交液： 7% SDS， 50mmol/L Na3PO4（ pH ）， 2% blocking stock solution， 5 SSC， 50％甲酰胺， %Sodium Nlauroyl Sarcoine ? Buffer I: mol/L maleic acid， mol/L NaCl（ pH ） ? Buffer II: 10% blocking stock solution (Antidig) ? Buffer III: mol/L Tris，
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