核酸分子雜交ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-28 01:09 本頁面
【文章內容簡介】 確定雜交溫度。 通常有三種溫度可供試驗，即最適復性溫度、苛刻復性溫度及非苛刻復性溫度。溫度的選擇及溫度對雜交的影響見下表。最適復性溫度（ Optimunm renaturation temperature, TOR）： Tor =Tm –25℃ 苛刻復性溫度： Ts = Tm – (10或 15℃ ) 非苛刻復性溫度： Tns =Tm – (30或 35℃ ) 在 2 SSC反應液中，可以根據下列公式計算最適復性溫度： TOr = (G+C%)+47℃ 。 DNA G+C % 雜交反應溫度（ ℃ ） Tor Ts Tns 30 35 40 45 50 55 DNA—DNA雜交溫度的選擇范圍（ 2 SSC） 如果綜合考慮： Effective Tm＝ +(logM[Na+])+(%G+C) – (%formamide) 根據所用的雜交溶液確定雜交的溫度：一般來說，雜交相為水溶液時 ,則在 65℃ 雜交，而在 50%甲酰胺溶液中時 ,則在 42℃ 下雜交。 離子強度 離子強度增加 ， Tm值增加 ， 一般用 mol/L 的NaCl DNA的濃度 最低檢測水平為單拷貝為： 探針的濃度： 總的來說，隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外，在較窄的范圍內，隨探針濃度增加，敏感性增加。要獲得較滿意的敏感性，膜雜交中 32P標記探針與非放射性標記探針的用量分別為 5～ 10ng/ml和 25～1000ng/ml 探針質量衡量的指標：比活性即 cpm/μg 如果比活性為 108cpm/μg ， 用的濃度為 10μg/ml， 比活性為 109cpm/μg ， 用的濃度為 2μg/ml。 探針的長度和同源性 ： 為了保證雜交的特意性，一般需要用 500pb左右的長度的探針。但是，探針過量的條件下，雜交率主要依賴于探針長度（復雜度）和探針濃度。在濃度一定時，雜交率主要影響因素是探針的長度，長的探針雜交時間很長，而短探針容易退火，因此標記好的探針長度為 100 nt左右，太短將探針與目的序列的結合。 探針與被檢測的 DNA之間的同源性也影響 Tm： 1% mismatch of two DNA lowers the Tm ℃ 如果雜交溫度為 ℃ ，要求 DNA間的同源性為%，在 65℃ 、 5xSSC的條件下，要求探針與被檢測的 DNA之間的同源性為多少？ 假設：％（ G＋ C）＝ 45％ Tm＝+()+(45%)=℃ 同源性＝ 100－ {(－ )/}=% 雜交液的成分 ： 反應液中每增加 1%的甲酰胺濃度， tm值可降低 ℃ 。 6M尿素，降低 Tm約 30℃ 惰性多聚體可用來促進 250個堿基以上的探針的雜交率。對單鏈探針可增加 3倍，而對雙鏈探針、隨機剪切或隨機引物標記的探針可增加高達 100倍。 硫酸葡聚糖是一種廣泛用于較長雙鏈探針雜交的促進劑。這是一種多聚胺，平均分子量為 500000。另一種常見的促進劑是聚乙二醇（ PEG）， PEG分子量?。?6000～8000）、粘度低、價格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些條件下 5%～ 10%硫酸葡聚糖效果較好，若用 5%～ 10%PEG則可產生很高的本底。因此，使用促進劑時有必要優(yōu)化條件。 選用不同的封閉試劑：如 Denhardt‘s試劑、肝素或一種由 5%脫脂奶粉組成的 BLOTTO或 block reagent , 這些試劑中需加入斷裂的鮭魚精子 DNA或酵母 DNA，并和 SDS一起使用。與 Denhardt39。s試劑相比 , BLOTTO價格便宜 ,使用方便 ,同樣可獲得滿意的結果，但它不能用于 RNA雜交。一般而言 ,尼龍膜用 Denhardt39。s試劑比用 BLOTTO能得到更高的信噪比。 雜交的時間 在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決
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